Structure cristalline du glucose de Leishmania donovani 6 - Série de sulfate de Harbin Co., Ltd

Communications Biology volume 5, Article number: 1353 (2022) Citer cet article

1102 Accès

1 Citations

6 Altmétrique

Détails des métriques

Étant donné que les parasites unicellulaires dépendent fortement du NADPH comme source de réduction des équivalents, la voie des pentoses phosphates, en particulier la première enzyme productrice de NADPH, la glucose 6-phosphate déshydrogénase (G6PD), est considérée comme une excellente cible médicamenteuse antitrypanosomatide. Nous présentons ici la structure cristalline de Leishmania donovani G6PD (LdG6PD) élucidant le domaine N-terminal unique des G6PD de Kinetoplastida. Nos recherches sur la fonction du domaine N suggèrent son implication dans la formation d'un tétramère qui est complètement différent des G6PD de Trypanosoma apparentés. Des investigations structurelles et fonctionnelles fournissent en outre des informations intéressantes sur le mode de liaison de LdG6PD, suivant un mécanisme ordonné, qui est confirmé par un changement de domaine induit par G6P et une rotation du domaine N hélicoïdal. Ensemble, ces connaissances sur le LdG6PD contribuent à la compréhension des mécanismes moléculaires des G6PD et fournissent une excellente base pour d'autres approches de découverte de médicaments.

La leishmaniose, maladie infectieuse à transmission vectorielle, est l'une des 20 maladies tropicales négligées liées à la pauvreté. Elle est causée par le parasite protozoaire du genre Leishmania, appartenant à la famille des Trypanosomatidae, et infecte 0,7 à un million de personnes avec 20 000 à 30 000 décès par an dans les régions tropicales, subtropicales et du sud de l'Europe. L'espèce Leishmania donovani provoque la forme la plus sévère, souvent mortelle si elle n'est pas traitée1,2. Actuellement, seuls quelques médicaments sont disponibles pour le traitement de la leishmaniose et après des décennies d'utilisation, des souches résistantes sont apparues3,4,5. Par conséquent, de nouvelles cibles médicamenteuses et des agents anti-infectieux dotés de nouveaux mécanismes d'action sont nécessaires de toute urgence.

Les enzymes de la voie des pentoses phosphates (PPP) sont considérées comme des cibles médicamenteuses prometteuses pour contrôler les trypanosomatides5,6,7. Tout au long de leur cycle de vie, les parasites doivent résister à l'action des espèces réactives de l'oxygène et de l'azote (ROS/RNS) produites par le système immunitaire de l'hôte8. Pour contrecarrer les mécanismes de défense antioxydants tels que le système thiol dépendant du trypanothione, qui est crucial pour l'équilibre redox chez les trypanosomatidés, les parasites dépendent fortement du NADPH en tant que source d'électrons primaire9,10. Le PPP, qui est divisé en une branche oxydative unidirectionnelle où le NADPH est produit, et une branche non oxydante qui se termine par le ribose 5-phosphate, un produit crucial pour la biosynthèse des nucléotides, contribue grandement au pool total de NADPH. L'enzyme domestique glucose 6-phosphate déshydrogénase (G6PD) (EC 1.1.1.49) est la première enzyme limitant la vitesse du PPP. Il catalyse l'oxydation du glucose 6-phosphate (G6P) issu de la glycolyse en 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone (6PL), le cofacteur NADP+ étant réduit en NADPH. 6-phosphogluconate déshydrogénase (EC 1.1.1.44), la troisième enzyme de cette branche oxydative génère une deuxième molécule de NADPH10. Chez les trypanosomatidés, l'enzyme malique, qui utilise le malate pour produire du pyruvate et du NADPH, fournit une deuxième source pertinente de NADPH11,12. Cependant, la régulation négative par l'ARNi de la G6PD ou de la 6-phosphogluconate déshydrogénase réduit fortement la croissance des parasites sanguins de Trypanosoma brucei, confirmant le rôle central de ces enzymes7,13. De plus, il a été démontré que certains stéroïdes humains (par exemple, la déhydroépiandrostérone, l'épiandrostérone) inhibent spécifiquement les G6PD de Trypanosoma, ce qui entraîne une croissance réduite du parasite et un équilibre redox détruit7,13,14,15. Étant donné que les promastigotes de Leishmania pénétrant dans les macrophages de mammifères sont exposés à un énorme stress oxydatif induit par des enzymes telles que la NADPH oxydase ou la NO-synthase16,17,18, un pool de NADPH adéquat est encore plus important pour ces parasites. De plus, on pense que le mode d'action des médicaments antileishmaniens couramment utilisés tels que l'amphotéricine B19, le gluconate d'antimoine de sodium20 et la miltefosine21 est lié à une production accrue de ROS et à une résistance à ces médicaments à une régulation positive du PPP18. Ces résultats indiquent clairement un rôle crucial de l'enzyme G6PD de la voie des pentoses phosphates pour la survie du parasite Leishmania et donc son excellente adéquation en tant que cible médicamenteuse, comme précédemment montré pour d'autres parasites unicellulaires tels que Trypanosoma7,13,14,15 et Plasmodium22,23,24 ,25.

Dans la présente étude, nous décrivons les structures cristallines de Leishmania donovani G6PD (LdG6PD), à la fois natives et complexées avec un ou les deux substrats. Le domaine N-terminal, unique aux G6PD de Kinetoplastida, est entièrement visible dans nos structures cristallines LdG6PD de type sauvage (wt). Deux mutants LdG6PD fournissent des informations intéressantes sur le rôle du domaine N-terminal supplémentaire, qui semble être essentiel pour la tétramérisation. Des études structurelles et cinétiques ont permis d'élucider davantage le mode de liaison au substrat de l'enzyme, qui semble suivre un mécanisme ordonné et se manifeste également par un changement de domaine dû à la liaison du G6P. Les caractéristiques structurelles et fonctionnelles rapportées de LdG6PD fournissent une excellente base pour d'autres études sur les inhibiteurs basés sur la structure et l'optimisation des médicaments.

G6PD de L. donovani (LdG6PD wt) et L. major (LmG6PD), ainsi que deux mutants LdG6PD (LdG6PDC138S, LdG6PD60–562), ont été produits par recombinaison (Fig. S1). Pour étudier le comportement d'oligomérisation des G6PD de Leishmania, nous avons effectué une chromatographie d'exclusion de taille (SEC) dans différentes conditions (voir méthodes). Les profils SEC de LdG6PD wt natif ont révélé deux pics stables avec des schémas d'élution équivalents aux formes tétramères et dimères de l'enzyme, le pic dimère dominant environ deux fois le pic tétramère, indépendamment de la concentration en enzyme (12–300 µM) (Fig. 1 ). Le même profil d'élution a pu être observé pour le LmG6PD wt natif. Les fractions dimères et tétramères sont restées dans leur conformation d'origine lorsqu'elles ont été collectées séparément et réappliquées à la colonne SEC (Fig. S2d). La cinétique à l'état d'équilibre a révélé une activité spécifique du dimère LdG6PD wt de 200,0 ± 14,1 U mg−1, avec des valeurs apparentes de KM de 54,4 ± 2,8 µM pour le substrat G6P et de 15,9 ± 1,1 µM pour le cosubstrat NADP+. Par rapport aux autres G6PD caractérisés jusqu'à présent, l'activité spécifique est remarquablement élevée, tout comme l'efficacité catalytique globale (tableau 1). En revanche, l'efficacité catalytique du tétramère LdG6PD était significativement plus faible car l'activité spécifique restait égale, mais le KM apparent pour le G6P était d'environ 40 % supérieur (75,4 ± 5,5 µM) par rapport à la fraction dimère. De plus, le schéma d'oligomérisation de LdG6PD n'a été affecté ni par la présence de substrats ni par la variation de la force ionique (0, 1 à 1 M NaCl) ou des valeurs de pH (4, 8 à 7, 8) (Fig. S2a, b). Néanmoins, des pH très bas (4,5) réduisent l'activité spécifique d'environ 40 % (114,5 + 8,2 U mg−1). De plus, ni les conditions réductrices (5 mM DTT) ni les conditions oxydatives (2 mM H2O2) n'ont affecté les schémas d'élution de LdG6PD par rapport aux conditions natives (Fig. S2c), suggérant la formation de dimères et de tétramères indépendants du statut redox et des liaisons disulfure intermoléculaires. Conformément à cela, les propriétés cinétiques de l'enzyme n'étaient pas affectées dans les mêmes conditions.

La G6PD pleine longueur a été filtrée sur gel sur une colonne HiLoad 16/60 Superdex 200 pré-équilibrée dans du tampon A (NaCl 500 mM, Tris 50 mM, pH 7,8). a Les profils SEC de LdG6PD wt (66,7 kDa) (pointillé noir, volume de rétention (vr) 1. pic = 58 mL = 300 kDa, vr 2. pic = 68 mL = 133 kDa) et LmG6PD wt (66,8 kDa) (gris , rv 1. pic = 59 mL = 276 kDa, rv 2. pic = 68 mL = 133 kDa) affichent deux pics avec des modèles d'élution équivalents à un dimère et un tétramère et sont restés stables dans le mutant LdG6PDC138S (66,7 kDa) (bleu, rv 1. pic = 59 mL = 276 kDa, rv 2. pic = 68 mL = 133 kDa). Le profil SEC du mutant LdG6PD60-562 (60,3 kDa) affiche un pic avec des modèles d'élution équivalents à un dimère (rouge, rv = 69 mL = 112 kDa). b Profils SEC de LdG6PD wt sous différentes concentrations enzymatiques, 300 µM (noir, rv 1. pic = 56 mL = 341 kDa, 2. Pic = 66 mL = 156 kDa), 80 µM (bleu, rv 1. pic = 58 mL = 300 kDa, rv 2. pic = 68 mL = 133 kDa) et 10 µM (rouge, rv 1. pic = 57 mL = 325 kDa, rv 2. pic = 67 mL = 144 kDa) affichent deux pics avec une élution stable motifs équivalents à un dimère et à un tétramère. Des chromatogrammes représentatifs (n ≥ 2) sont présentés pour chaque condition.

Nous avons obtenu des cristaux monocliniques et orthorhombiques de LdG6PD wt, LdG6PDC138S et LdG6PD60–562 (tableau 2). Les cristaux de l'apoenzyme obéissaient à la symétrie P121 avec quatre monomères dans l'unité asymétrique (AU) et diffractaient à 2,8 Å. Les cristaux LdG6PD wt et LdG6PDC138S en complexe avec et sans son substrat G6P et/ou son cofacteur NADP(H) ont cristallisé dans le groupe spatial C121 avec deux monomères dans l'UA. Cristaux contenant uniquement du NADP(H) diffractés à une résolution allant jusqu'à 1,7 Å, et cristaux contenant du G6P ou du G6P et du NADP(H) à 3,3 Å et 2,5 Å, respectivement. Le cristal du mutant tronqué LdG6PD60–562 obéissait à la symétrie C222 avec un monomère dans l'UA et diffractait à 1,9 Å.

La structure de l'apoenzyme a été résolue à une résolution de 2,8 Å via la méthode de remplacement moléculaire, en utilisant HsG6PD (PDBID : 5UKW) comme modèle de recherche. Les données de diffraction de tous les autres cristaux ont été mises en phase via des méthodes de remplacement moléculaire en utilisant la structure de l'apoenzyme. Toutes les statistiques de collecte de données et de raffinement sont résumées dans le tableau 2. La densité électronique du noyau LdG6PD, comprenant les résidus 5-470 et 483-552, est bien définie dans toutes nos structures à l'exception de deux boucles comprenant les résidus D50-K64 et T471-D482. Ces boucles ont un facteur B accru; dans certaines structures, ils ne sont pas définis par la densité électronique (tableau S1).

Semblable à d'autres G6PD de cette famille, le dimère LdG6PD (Fig. 2a) adopte le pli G6PD canonique avec des valeurs RMSD pour le domaine central du dimère de 2, 6 Å et 2, 1 Å pour l'homme (HsG6PD; PDBID: 2BH9) et Trypanosoma cruzi G6PD (TcG6PD ; PDBID : 5AQ1)26,27,28,29, respectivement (Fig. S3). Le monomère LdG6PD contient trois domaines : un domaine N (Q5-K49), le domaine "Rossmann-like" de liaison NADP+ (résidus D50-I248) et un domaine β + α (résidus D249-K552). Chaque sous-unité a un site actif discret avec un domaine de liaison NADP+ et G6P. Ce dernier est situé entre le "Rossmann-like" et le domaine β + α. Le domaine N est constitué de deux hélices a comprenant les résidus Q5-K49 et est lié au domaine "Rossmann-like" via une boucle de connexion (D50-K64).

un dimère LdG6PD wt en complexe avec NADP (H) (PDBID : 7ZHU) avec la position P1 du domaine N B (NB) est présenté sous forme de ruban. Le domaine β-α (D249-K552) des sous-unités A et B est coloré respectivement en violet clair et bleu clair. Le domaine "de type Rossmann" (D50-I248) des sous-unités A et B est coloré respectivement en magenta foncé et en bleu marine. Le domaine N hélicoïdal avec les hélices α1 (~D11-R31) et α2 (~I36-K49) est coloré en magenta dans la sous-unité A (NA) et en cyan dans la sous-unité B (NB). La boucle de connexion (résidus D50-K64 dans les sous-unités A et B) entre le domaine N- et le domaine "Rossmann-like", est colorée en vert. Les régions avec une densité électronique mauvaise ou manquante sont indiquées en pointillés (sous-unité A : D50-S55, Y476-R479 ; sous-unité B : R51-E54). L'hélice α14 dans le cadre du site de liaison G6P, la boucle flexible (T471-D482) et les cystéines importantes (C56, C61, C97, C138, jaune) sont étiquetées. NADP (H) (jaune) et G6P (vert) et les résidus sont présentés sous forme de modèles de bâton. Pour marquer la poche de liaison G6P, G6P est tiré de la structure superposée avec G6P lié (rubans non représentés, PDBID : 7ZHZ). b Dimère et tétramère LdG6PD schématiques impliquant la position P1 du domaine N B (NB). La sous-unité B est colorée en bleu et NB de la sous-unité B en position P1 est colorée en cyan. Les sous-unités A et A' avec le domaine N A (NA) et A' (NA') sont colorées en magenta. c Dimère et tétramère LdG6PD schématiques impliquant la position P2 du domaine N B (NB). La sous-unité B est colorée en bleu et NB de la sous-unité B en position P2 est colorée en vert. Les sous-unités A et A' avec NA et NA' sont colorées en magenta (créées avec BioRender.com).

La forme apo cristallise dans le groupe spatial P121 avec deux dimères (AB et CD) dans l'UA. Via l'opération de symétrie P121, un tétramère peut être formé à partir de chaque dimère (ABA'B' ou CDC'D') (Figs. 2b, c, 3a). En revanche, le mutant LdG6PD wt et le mutant LdG6PDC138S, complexés avec NADP(H), G6P ou les deux substrats, adoptent la symétrie du groupe spatial C121 avec un dimère dans l'AU (AB). Cependant, via une opération de symétrie cristallographique, le même type de tétramère peut être formé qu'avec la forme apo (Fig. 3b). L'analyse de ce tétramère, comprenant deux AU, a révélé deux positions P1 et P2 du domaine N de la sous-unité B (NB), qui sont liées par une opération de symétrie cristallographique et toutes deux situées à proximité du domaine principal des sous-unités B et B', respectivement . De plus, la densité électronique de la boucle D50-K64 (varie selon la structure, tableau S1), reliant le domaine principal de la sous-unité B à NB, est très faible. Enfin, nous avons choisi d'associer P1 à la sous-unité B et déposé l'AU avec ce contenu dans le PDB (Fig. 2a). La position du domaine N A (NA) est sans ambiguïté et décrite ci-dessous.

Les tétramères de l'apo a et les structures complexées au NADP(H) b sont représentés dans la même orientation. Le domaine β-α (D249-K552) des sous-unités A/A' et B/B' est coloré respectivement en violet clair et bleu clair. Le domaine "de type Rossmann" (D50-I248) des sous-unités A/A' et B/B' est coloré respectivement en magenta foncé et en bleu marine. une structure apo. Le domaine N-terminal hélicoïdal avec α1 (~D11-R31) et α2 (~I36-K49) est coloré en gris dans les sous-unités A et A' (domaines N NA et NA') et coloré en cyan foncé dans les sous-unités B et B' (N-domaines NB et NB' avec la position P1). Les lignes pointillées indiquent les régions avec une densité électronique mauvaise ou manquante (sous-unité A/A' : G52-V63 ; sous-unité B/B' : K49-K62, T474-D477). b Structure complexée au NADP(H). Les domaines N NA et NA' sont colorés en magenta et les domaines N NB et NB' (position P1) sont colorés en cyan. La boucle de connexion (D56-K64) est colorée en vert et les lignes pointillées indiquent les régions avec une densité électronique mauvaise ou manquante (sous-unité A/A' : D50-S55, Y476-R479 ; sous-unité B/B' : R51-E54). NADP (H) (jaune) et G6P (vert) et les résidus sont présentés sous forme de modèles de bâtons. Des résidus importants de la boucle flexible (T471-D482) et de l'hélice connectée α14 (P481-L492) sont directement ou indirectement affectés par les domaines N et marqués par des étiquettes ou des flèches. La structure apo et la structure complexée au NADP(H) ont été utilisées (PDBID : 7ZHT, 7ZHU), et le G6P est tiré d'une structure superposée avec le G6P lié (ruban non représenté, PDBID : 7ZHZ).

Comme mentionné ci-dessus, chaque domaine N comprend deux hélices α1 (~ D11-R31) et α2 (~ I36-K49) reliées par une boucle courte (Figs. 2, 4). Les contacts tétramères entre les quatre sous-unités (A, B, A', B') existent principalement entre les hélices α des domaines N (Fig. 3). La liaison au substrat influence les contacts entre les sous-unités et est décrite plus en détail dans la section suivante.

Les dimères des structures apo et NADP(H)-complexées sont représentés dans la même orientation (PDBID : 7ZHT, 7ZHU). Le domaine β-α des sous-unités A ou B est coloré respectivement en violet clair et bleu clair. Le domaine "de type Rossmann" de la sous-unité B est coloré en bleu marine. La boucle de connexion (D50-K64) est colorée en vert. une structure apo : le domaine N A (NA) est coloré en gris. b Structure apo : le domaine N B (NB, position P1) est coloré en cyan foncé. c Structure complexée au NADP(H) : le domaine N A (NA) est coloré en magenta. d Structure complexée au NADP(H) : le domaine N B (NB, position P1) est coloré en cyan ; Le NADP(H) est coloré en jaune. Les résidus importants sont indiqués dans les modèles de bâton et les liaisons hydrogène sont indiquées par des lignes pointillées noires. Les hélices α et les feuillets β respectifs sont numérotés.

La superposition de la structure dimère apo LdG6PD (PDBID : 7ZHT) avec les structures LdG6PD complexées au NADP(H) (PDBID : 7ZHU, 7ZHY) a révélé des valeurs RMSD de 1 Å avec 982 et 978 résidus, respectivement. La comparaison de la structure apo (Figs. 3a, 4a, b) avec les structures complexées avec G6P, NADP(H) ou les deux substrats (Figs. 3b, 4c, d) révèle une rotation du domaine N d'environ 45° sur le ligand obligatoire. Contrairement à ce réalignement frappant des domaines N, seules des différences marginales dans la position des domaines N sont évidentes entre les structures liées au ligand.

Dans la structure apo, le domaine N de la sous-unité A (NA) interagit avec la boucle flexible (T471-D482) des deux sous-unités (Fig. 3a). Au sein de la sous-unité A, les résidus hélicoïdaux A26A-E30A (α1) interagissent avec les résidus de boucle Y472A-Y476A (Fig. 4a). Les résidus E30A-K32A sont liés au brin β S442A-A444A (β13). De plus, la chaîne latérale R31A interagit avec E467A et D469A (β14). Lors de la liaison du substrat, les contacts avec β13 sont perdus en raison de la rotation de NA et du déplacement résultant des résidus E30A-K32A (Fig. 4c). Cependant, la boucle flexible (T471A-D482A) de la sous-unité A se réorganise également, conservant ainsi la liaison T474A et Q27A (α1). En raison de la faible densité électronique, cette interaction n'est pas observée dans les structures avec du G6P lié (tableau S1). Comme dans un tourniquet, les liaisons entre R31A et E467A et D469A restent intactes car les chaînes latérales se réarrangent également.

De plus, NA (structure apo) interagit non seulement avec la sous-unité A mais également avec B; l'extrémité N-terminale de l'hélice α2A (Q38A) est liée aux résidus de boucle flexible T471B et H473B (Figs. 4a, S4a). La rotation du domaine N (NA) due à la liaison au substrat remplace ce contact via des interactions hydrophobes entre D34A-D35A et T474B-R475B (Figs. 4c, S4b). Cette dernière interaction est bien définie par la densité électronique dans presque toutes nos structures avec des substrats liés à l'exception de celles à faible résolution (3, 3 Å) (tableau S1).

Comme mentionné précédemment, il existe deux positions P1 et P2 du domaine N NB, qui peuvent être liées au domaine principal de la sous-unité B ou B', respectivement. La liaison de P1 à la sous-unité B (Fig. 2b) n'entraîne aucune interaction dimérique entre NB et la sous-unité A, mais dans toutes nos structures, il existe de multiples contacts avec le domaine "de type Rossmann" de la sous-unité B. Dans la forme apo, α1B ( A12B-Q27B) interagit via les forces de van der Waals avec les résidus hélicoïdaux D117B-W121B (α4B) et E135B-E141B (α5B) (Fig. 4b). Lors de la liaison au substrat et de la rotation résultante de NB, les interactions sont visibles entre les résidus hélicoïdaux G19B-A26B (α1B), H123B-K128B (α4B) et E141B (α5B) (Fig. 4d). De plus, Q27B est lié par une liaison hydrogène à S134B. Les contacts tétramères entre les quatre sous-unités (A, B, A', B') existent principalement entre les hélices α des domaines N (Figs. 2b et 3). Remarquablement, il existe un contact tétramérique supplémentaire, formé entre NB (Q48B – K49B) et la boucle flexible (Y476B'-D477B') de la sous-unité B' et vice versa.

Si nous connectons la position P2 du domaine N NB à la sous-unité B, les interactions dimères décrites ci-dessus avec le domaine "de type Rossmann" auraient lieu entre NB et la sous-unité B' et seraient donc des interactions tétramères (Fig. 2c). Cependant, les interactions entre les résidus Q48B-K49B et les résidus de boucle Y476B-D477B ne se produiraient qu'au sein de la sous-unité B, plutôt qu'entre deux dimères comme dans l'association de P1 à la sous-unité B (Fig. 3b). De plus, relier P2 à la sous-unité B entraîne des connexions très fragiles entre le N- et le domaine principal. La connexion se ferait via les résidus de boucle Q48B-K64 B et Y476B-D477B (Fig. 3b), qui présentent des facteurs B accrus ou sont désordonnés dans certaines structures (Tableau S1). Pour ces raisons, nous considérons qu'il est plus probable que P1 et non P2 du domaine N NB soit associé à la sous-unité B.

Cependant, les changements conformationnels décrits lors de la liaison NADP(H) ne se sont pas étendus à la poche de liaison NADP+. Par conséquent, seules des différences mineures se sont produites entre la structure apo et les structures complexées avec NADP(H) ou G6P en ce qui concerne la poche de liaison NADP+. Les résidus formant la poche de liaison NADP + sont illustrés à la figure 5a.

Les rubans et résidus du domaine "Rossmann-like" sont colorés en bleu marine et du domaine β-α en bleu clair. a Gros plan sur la poche de liaison NADP+ des structures LdG6PD (PDBID : 7ZHU) au sein du domaine "Rossmann-like". Le fragment NADP(H) est coloré en jaune. La carte de densité électronique (FO-FC polder omit map) profilée à 4,0 σ pour NADP (H), est représentée en noir. b Gros plan de la poche de reliure G6P. G6P est représenté sous deux conformations. En marron, la conformation G6P de la structure TcG6PD superposée (PDBID : 5AQ1) avec le cycle pyranose pointant vers le fragment NADP(H) (jaune). En vert, la conformation G6P des structures LdG6PD (PDBID : 7ZHZ). La carte de densité électronique (FO-FC polder omit map) contournée à 4,0 σ pour G6P est représentée en noir. Les résidus du NADP + et de la poche de liaison G6P sont représentés dans des modèles de bâtonnets, et les liaisons hydrogène sont indiquées par des lignes pointillées noires ou par des lignes pointillées grises pour le fragment G6P de la structure TcG6PD.

Des changements de conformation significativement plus importants que dans les structures complexées avec le NADP(H) sont observés après la liaison du substrat G6P. Superposition des structures dimères complexées au G6P (PDBID : 7ZHV) ou au G6P et au NADP(H) (PDBIDs : 7ZHW, 7ZHZ) avec soit la forme apo (PDBID : 7ZHT ; 965 résidus) soit la forme liée au NADP(H) (PDBID : 7ZHU ; 1055 résidus) a révélé des valeurs RMSD de 1,6 et 1,8 Å, respectivement. De plus, l'angle entre le domaine "de type Rossmann" et le domaine β + α est réduit lorsque G6P est lié (Fig. 6a). Il existe des différences conformationnelles significatives au voisinage de la poche de liaison G6P dans les structures avec (PDBID : 7ZHZ) et sans G6P lié (PDBID : 7ZHU, 7ZHY). La comparaison structurelle des monomères montre que les régions I248–I260 (α9) et P481–F499 (α14) se réarrangent, les atomes de la chaîne principale se déplaçant d'environ 1, 5 Å et la chaîne latérale Y251 d'environ 3 Å (Fig. 6a, b). De plus, les résidus H250, K254, M256 (α9), H312 (α12) et Y484 (α14) adoptent différentes conformations de chaîne latérale (Fig. 6b). De plus, dans les structures sans G6P lié, les atomes du squelette D482-A483 sont situés à la même position que le cycle pyranose du G6P dans les structures complexées au G6P. Remarquablement dans toutes les structures, le G6P n'est lié que dans la sous-unité B du dimère G6PD, bien que les sous-unités A et B soient essentiellement similaires (RMSD ~ 0,7 Å). Des déplacements mineurs (~0,7 Å) se produisent pour les régions D117-E135 (α4) et le cofacteur NADP(H), et des déplacements légèrement plus élevés sont observés pour Y251 (1,5 Å) et les résidus P481-L492 (α14 ; 1,3 Å).

Superposition de la structure complexée au NADP(H) (PDBID : 7ZHU ; bleu) avec la structure complexée au G6P et au NADP(H) (PDBID : 7ZHZ ; jaune). Le résidu Y251 (rouge) marque le déplacement du site actif induit par G6P de la boucle comprenant les résidus H250-K254. a Les dimères superposés (seul le monomère B est représenté) montrent le décalage induit par le G6P du domaine N- et du domaine "Rossman-like". Le résidu D482 (rouge) marque la fin de la boucle flexible (T471-D482), reliée à α14 b Gros plan sur le site actif. Ici, les monomères B des deux structures sont superposés. La superposition montre les différentes conformations de chaînes latérales des résidus tapissant le site de liaison G6P et le réarrangement de la région H250-K254. c, d Comparaison avec les orthologues. c Superposition du tétramère T. cruzi G6PD avec le mutant LdG6PD60-562. Les deux enzymes ont été cristallisées sans les domaines N hélicoïdaux. L'apo-structure du tétramère TcG6PD (PDBID : 6D23) avec les sous-unités AD est colorée en marron et celle du tétramère LdG6PD60–562 complexé au NADP(H) (PDBID : 7ZHX) en bleu clair. d Sites actifs superposés de la structure LdG6PD (avec G6P et NADP(H) liés ; PDBID : 7ZHZ ; jaune) avec la structure TcG6PD (avec G6P lié ; PDBID : 5AQ1 ; marron) et HsG6PD (avec NADP+ lié ; PDBID : 2BH9 ; violet). La figure d est représentée dans la même orientation que b. Les hélices α et les feuillets β respectifs sont numérotés.

La comparaison avec des structures homologues, dans lesquelles le cycle pyranose de G6P pointe vers NADP +, a révélé une poche de liaison G6P correspondante dans LdG6PD, qui est formée par les résidus K220, D249-Y251, F286-E288, K406 et K411-V413 (Fig. 5b ). Selon les structures homologues, le cycle pyranose du G6P serait coordonné par les résidus K220, E288, I304, D307, H312 et K406, et le fragment phosphate serait lié par les résidus H250, Y251, K254, K411 et Q440.

Cependant, dans les structures LdG6PD liées au G6P, la position du G6P qui explique le mieux la densité électronique est différente de celle des structures G6PD homologues26,27,28,29. Par rapport à ces structures, la conformation G6P est tournée de 180 ° et située dans une fente, formée par les acides aminés D482-A483, Q440, H250-Y251 et K254 (Fig. 5b). Le cycle pyranose est lié par une liaison hydrogène à K254, A483 et Q440, qui interagit également avec le phosphate. Fait intéressant, dans les structures homologues, le résidu K254 est utilisé pour la liaison au phosphate. Dans nos structures, le phosphate est lié par les résidus H250, Y251 et K411. Dans l'ensemble, la fraction phosphate se déplace de seulement 1,7 Å par rapport aux structures G6PD homologues (PDBID : 5AQ1, 6D24).

Pris ensemble, la liaison NADP (H), G6P ou les deux entraîne un décalage de rotation des deux domaines N. Cela affecte les interfaces entre les domaines N et le domaine central, en particulier la région de contact avec la boucle flexible T471-D482, de sorte que les résidus de α14 (P481-L492) qui participent à la liaison G6P sont également affectés. Le site de liaison NADP+ est moins affecté avec seulement des changements mineurs. De plus, la liaison de G6P induit un réarrangement structurel des résidus I248-I260 (α9) et P481-F499 (α14). Sans G6P lié, les chaînes latérales H250 et K254 sont opposées à la poche de liaison, ce qui rend impossible l'interaction habituelle avec G6P (Fig. 6a, b). De plus, Y251 pointe dans la poche de liaison G6P, ce qui conduirait à des conflits avec la fraction phosphate de G6P dans LdG6PD et des structures homologues (Fig. 6b, d).

Pour étudier une fonction potentielle du domaine N hélicoïdal conservé dans les G6PD de Kinetoplastida, nous avons généré un mutant de troncature dépourvu du domaine N qui comprend les résidus 1 à 59 (LdG6PD60-562). De plus, la structure LdG6PD wt, complexée avec NADP(H), a révélé une liaison disulfure entre C138 et C56 ; cependant, avec des changements conformationnels mineurs, une liaison disulfure alternative entre C138 et C61 ou C56 et C97 est également possible (Fig. 2a). Par conséquent, nous avons généré un deuxième mutant en remplaçant C138 par une sérine (LdG6PDC138S). Nous avons émis l'hypothèse que les deux mutations altéreront l'activité enzymatique en raison de la troncature ou de l'orientation altérée du domaine N.

La comparaison des structures LdG6PDC138S aux structures wt n'a révélé aucun changement conformationnel majeur (RMSD = 0, 4 Å avec 1056 résidus). En conséquence, la mutation n'a révélé aucun pont disulfure alternatif et le profil d'oligomérisation ne différait pas significativement du wt (Fig. 1a). Bien que le KM de G6P ait augmenté d'environ 20 %, indiquant une affinité plus faible, l'activité Vmax a augmenté dans la même mesure de sorte que l'efficacité catalytique est restée stable (tableau 1). Pour le NADP+, l'efficacité catalytique a légèrement augmenté de 14,5 ± 1,6 µM−1 s−1 à 17,3 ± 0,8 µM−1 s−1 en raison de l'augmentation de Vmax mais du KM stable.

Contrairement aux cristaux wt et LdG6PDC138S, qui contiennent le dimère physiologique dans l'UA, le mutant de troncature LdG6PD60–562 a cristallisé dans un groupe d'espace orthorhombique (C222) avec une molécule dans l'AU (tableau 2). Par conséquent, le dimère physiologique est formé par un double axe de rotation cristallographique. Cependant, notre tétramère habituel (Fig. 3) ne peut pas être construit via des opérations de symétrie cristallographique. Au lieu de cela, un tétramère différent est formé via des opérations de symétrie C222 (figure 6c), qui ressemble de manière intéressante au tétramère G6PD des espèces apparentées de Trypanosoma. Ici, l'interface dimère-dimère LdG6PD est principalement formée de ponts salins (R268, K324, R326, D335, E336 et D393), en maintenant les dimères dans une orientation dos à dos. Semblables à notre mutant de troncature, les G6PD de Trypanosoma ont toujours été cristallisées sous des formes tronquées et sont donc dépourvues des 57 ou 37 premiers résidus N-terminaux28,29.

La superposition des dimères LdG6PD60–562 (PDBID : 7ZHX) et LdG6PD wt respectifs liés au NADP(H) (PDBID : 7ZHU) a révélé un décalage global de 0,8 Å (475 résidus) et de petits décalages (jusqu'à 1,4 Å) du β + domaines α et "de type Rossmann", résultant en une conformation légèrement plus ouverte du mutant de troncature. Conformément à ces résultats structuraux et contrairement à l'équilibre dimère-tétramère stable de LdG6PD wt, le tétramère n'était plus visible dans les profils SEC de LdG6PD60–562 mais seulement un seul pic correspondant à la forme dimère du mutant ( Fig. 1a). Cependant, les observations cristallographiques et SEC n'ont pas été reflétées par une efficacité catalytique altérée de l'enzyme (tableau 1).

Afin de déterminer le mécanisme de liaison catalytique des substrats, G6P et NADP + ont été titrés à diverses concentrations constantes du second substrat, et la relation entre la concentration du substrat et la vitesse initiale de l'enzyme a été analysée. Pour les deux substrats, l'intersection des tracés Lineweaver – Burk à gauche de l'ordonnée indique un mécanisme d'ordre séquentiel de liaison au substrat, dans lequel les deux substrats doivent se lier à l'enzyme avant que la formation du produit puisse se produire30 (Fig. 7a, b). De plus, les lignes se coupent en dessous de l'abscisse, indiquant que la liaison du premier substrat favorise la liaison du deuxième substrat.

a NADP+ et b G6P, ainsi que c, f NADPH et d, e glucosamine 6-phosphate (GlcN 6-P) ont été titrés à différentes concentrations constantes du substrat G6P ou du cosubstrat NADP+. Les tracés primaires doubles réciproques de [U/100 mg]-1 contre [G6P]-1 et [NADP+]-1, respectivement, sont présentés. Les tracés a et b s'interceptent à gauche de l'ordonnée, indiquant un mode de liaison séquentiel des substrats. Les tracés c, e et f s'interceptent en ordonnée, indiquant une inhibition compétitive du NADPH contre le NADP+ et le G6P et du GlcN 6-P contre le G6P, mais pas contre le NADP+. d Des graphiques représentatifs de trois répétitions indépendantes sont présentés.

Pour différencier les mécanismes séquentiels ordonnés et aléatoires de LdG6PD, nous avons mené des études d'inhibition avec le produit inhibiteur NADPH et l'inhibiteur sans issue glucosamine 6-phosphate (GlcN 6-P), un analogue de G6P31,32,33. Le NADPH s'est avéré être un inhibiteur compétitif par rapport au NADP + dans LdG6PD, comme l'indique l'intersection sur l'axe des x (Fig. 7c) et l'augmentation des valeurs de KM avec l'augmentation des concentrations d'inhibiteur (Fig. S5a). De même, GlcN 6-P montre un schéma d'inhibition compétitive vis-à-vis de G6P (Figs. 7e, S5c). Vis-à-vis du NADP +, GlcN 6-P n'a eu aucun effet inhibiteur (Figs. 7d, S5b). En revanche, le NADPH s'est également avéré être un inhibiteur compétitif vis-à-vis du G6P (Figs. 7f, S5d).

Dans ce travail, nous présentons la structure cristalline et la caractérisation biochimique de Leishmania donovani G6PD. Nous avons pu visualiser le domaine N, qui est unique chez Trypanosomatida, fournissant des informations intéressantes sur sa fonction et suggérant un rôle central dans l'oligomérisation. De plus, nous avons détecté des déplacements de domaine induits par le substrat s'étendant jusqu'au site actif de l'enzyme. Ces changements conformationnels n'ont jamais été observés dans les autres G6PD décrits jusqu'à présent. Les données cristallographiques correspondent également parfaitement au mécanisme de liaison déterminé cinétiquement de LdG6PD. Enfin, une activité catalytique beaucoup plus élevée que les G6PD homologues a soutenu ces caractéristiques uniques, soulignant le rôle central de cette enzyme pour aider les parasites Leishmania à faire face au stress oxydatif.

Nos investigations cinétiques ont révélé une activité spécifique d'environ 200 U mg-1 (tableau 1) de LdG6PD et LmG6PD recombinants, avec une efficacité catalytique 3 à 4 fois supérieure à celle des G6PD d'autres espèces. De plus, les profils SEC de wt LdG6PD et LmG6PD ont révélé deux pics dans des conditions natives, équivalents à un dimère et à un tétramère (Fig. 1a), alors que la fraction tétramère présentait une efficacité catalytique réduite par rapport au dimère. Par conséquent, les G6PD de Leishmania existent potentiellement en équilibre dimère-tétramère dynamique, comme avec les autres G6PD26,29,33,34. Cependant, contrairement aux G6PD homologues35,36,37, la variation de la force ionique, du pH, de la concentration en enzyme ou de la présence de substrats n'a pas affecté cet équilibre (Fig. 1b, S2). L'efficacité catalytique de LdG6PD est également restée inchangée dans ces conditions, sauf à un pH très bas (4,5), entraînant une diminution de 40 % de l'activité. Cependant, les amastigotes de Leishmania en particulier parviennent à maintenir le pH cytosolique largement neutre dans la vacuole parasitophore acide38, et l'activité enzymatique pourrait être restaurée lorsqu'elle est mesurée à pH neutre (7,5). De plus, les agents réducteurs ou oxydants n'affectaient ni l'oligomérisation ni l'efficacité catalytique du LdG6PD, alors que l'activité enzymatique du TcG6PD apparenté était presque abolie dans de telles conditions29,39. La résistance de LdG6PD aux conditions environnementales changeantes est probablement une adaptation des parasites Leishmania, qui sont exposés à un environnement extrêmement redox-actif dans la vacuole parasitophore des macrophages hôtes et dépendent donc d'un pool adéquat de NADPH dérivé de G6PD.

Il a déjà été démontré que d'autres G6PD de trypanosomatides, comme celles de Trypanosoma cruzi ou de Crithidia fasciculate, forment des tétramères avec une orientation dos à dos des deux dimères et une interface dimère-dimère formée principalement par des ponts salins28,29. Étant donné que les acides aminés respectifs sont conservés dans Kinetoplastida, donc également présents dans les G6PD de Leishmania, il a été postulé que tous les G6PD de Kinetoplastida forment probablement ce type de tétramères28,29. Cependant, bien que les profils LdG6PD SEC aient montré un pic de tétramère supplémentaire, la force ionique variable n'a pas affecté l'équilibre dimère-tétramère de LdG6PD wt, suggérant une contribution mineure des ponts salins dans la formation de tétramère LdG6PD.

Les G6PD de T. cruzi étaient toujours cristallisées sous forme de variantes tronquées sans le domaine N-terminal28,29. Si nous tronquons également l'intégralité du domaine N dans LdG6PD (LdG6PD60–562), nous sommes en mesure de construire via des opérations de symétrie cristallographique le même arrangement de tétramère que celui observé pour TcG6PD (Fig. 6c). Cependant, le profil SEC du mutant de troncature présentait un dimère pur, sans la fraction tétramère supplémentaire (Fig. 1a). Nos études de cristallisation avec LdG6PD pleine longueur révèlent toujours un tétramère dans lequel les domaines N forment l'interface dimère-dimère conduisant à une orientation face à face des deux dimères (Fig. 3). Par conséquent, nous suggérons que les domaines N sont essentiels pour former le tétramère LdG6PD.

Conformément aux découvertes précédentes sur TcG6PD28, 29, 39, la troncature du domaine N n'a pas modifié l'efficacité catalytique du dimère LdG6PD (tableau 1). Seuls des changements conformationnels mineurs des domaines centraux dans la structure cristalline de LdG6PD60–562 ont confirmé cela par rapport au wt.

Comme mentionné précédemment, nous avons observé une efficacité catalytique réduite du tétramère avec un KM accru pour le G6P mais une activité similaire par rapport au dimère. Puisqu'il existe deux positions possibles du domaine N de la sous-unité B (NB), le choix de P1 ou P2 détermine les contacts dimères et tétramères (Figs. 2b, c, 3). Si la position P1 appartient au monomère B (Fig. 2b), un tétramère est formé avec une interface dimère-dimère entre les domaines N. Un autre contact tétramère dans ce scénario existe entre NB et la boucle flexible (T471-D482) de la sous-unité B 'et vice versa entre le domaine N de la sous-unité B' (NB') et la sous-unité B (Fig. 3b). A l'inverse, si on associait la position P2 au monomère B (Fig. 2c), ces contacts seraient dimériques, et l'interface dimère-dimère du tétramère se réduirait à l'interaction entre l'hélice α1 de NB ou NB' et le "Rossmann- comme "domaine (α4) de la sous-unité B' ou B, respectivement. Nous supposons que P1 du domaine N NB est connecté à la sous-unité B. Par conséquent, le domaine N de la sous-unité B' (NB') influence la boucle flexible (T471-D482) de la sous-unité B et affecte par conséquent le site de liaison G6P (α14 ; P481-L492) (Fig. 3, 6a, b). Cette interaction tétramère explique parfaitement l'augmentation de KM pour G6P du tétramère, alors que KM de NADP + et l'activité globale sont restées inchangées par rapport au dimère.

Enfin, quelle fonction le tétramère a in vivo doit encore être clarifiée. Bien que les conditions que nous avons testées n'aient eu aucun effet sur l'oligomérisation, de nombreux autres facteurs pourraient influencer l'équilibre dimère-tétramère, tels que le rapport produit sur substrat, divers autres ROS ou des interactions protéiques. Par exemple, p53 est connue pour réguler l'activité de la G6PD humaine40, et chez les trypanomatides, on pense que la trypanothione réductase, un consommateur direct de NADPH, interagit avec la G6PD41. Peut-être que le domaine N unique est également impliqué dans de telles interactions protéiques, mais cela doit être étudié dans d'autres études.

Le mécanisme cinétique de divers G6PD a été étudié de manière intensive et discuté de manière controversée. Alors que les études cinétiques soutiennent un mécanisme de liaison séquentiel ordonné pour de nombreux G6PD31,42,43,44, un mécanisme séquentiel aléatoire à équilibre rapide a été démontré pour d'autres tels que HsG6PD et P. falciparum G6PD32,33. Pour étudier plus en détail les mécanismes de liaison séquentielle de LdG6PD, nous avons utilisé des études d'inhibition de produit (Fig. 7). Dans des conditions saturantes, le NADPH agit comme un inhibiteur compétitif contre le NADP+, tout comme l'inhibiteur sans issue glucosamine 6-phosphate (GlcN 6-P) contre le G6P. De manière surprenante, le NADPH agit également comme un inhibiteur compétitif contre le G6P lorsque le NADP+ est en saturation, tandis que le GlcN 6-P n'entre pas en compétition avec le NADP+ lorsque le G6P est en saturation. Ces observations suggèrent que le NADP+ peut se lier aussi bien à l'enzyme libre qu'au complexe binaire enzymatique avec le G6P déjà lié, alors que le G6P préfère se lier à l'enzyme libre. Cela indique que LdG6PD suit un mécanisme séquentiel ordonné, où la liaison au substrat et la libération du produit se produisent de manière spécifiquement ordonnée. Nos données suggèrent même que LdG6PD suit un mécanisme ordonné spécial, le mécanisme Theorell-Chance (Fig. 8). Dans ce cas particulier, la liaison au substrat et la libération du produit se produisent si rapidement que le complexe ternaire EAB (LdG6PD-G6P-NADP+) n'existe que pendant une très courte période et n'est donc pas cinétiquement significatif30,45. Pour LdG6PD, cela signifie que le substrat G6P (A) se lie d'abord pour construire EA (LdG6PD-G6P) suivi de la liaison du cosubstrat NADP+ (B) pour former le produit 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone (6PL ) (P), suivi de la formation de NADPH (Q). Cependant, la formation de produits (P, Q) se produit immédiatement après la liaison de NADP + (B) de sorte que les complexes ternaires EAB et EPQ existent de manière transitoire mais à une concentration si faible qu'ils ne peuvent pas être détectés via des études de vitesse initiales.

Le G6P se lie d'abord au LdG6PD suivi du NADP+ pour générer les produits 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone (6PL) et NADPH sans former de complexe ternaire significatif ; E = enzyme LdG6PD.

Cela correspond bien à nos observations cristallographiques de LdG6PD. Nous avons observé des changements conformationnels par rapport à la structure apo dus à la liaison G6P seule (Fig. 6a, b). Dans la poche de liaison G6P, ce changement conformationnel était principalement visible à travers Y251 et les résidus environnants (H250-Y254) (Fig. 6b). Dans les structures sans G6P lié, ces résidus (H250-Y254) pointent toujours vers la poche de liaison G6P, rendant la catalyse impossible.

Fait intéressant, le NADP(H) est toujours visible dans les deux monomères du dimère, tandis que le G6P n'est visible que dans le monomère B. Par conséquent, il semble que les deux monomères ne convertissent pas leurs substrats de manière synchrone mais plutôt retardés l'un de l'autre, dans lequel l'occupation d'un site de liaison supprime la catalyse de l'autre. La rotation de 45° induite par le substrat des domaines N par rapport à la structure apo pourrait être impliquée dans ce phénomène (Figs. 3, 6). Par conséquent, la rotation du domaine N modifie les contacts du domaine N vers la chaîne principale et l'interaction entre toutes les sous-unités. Par conséquent, les contacts du domaine N A avec la boucle flexible B sont réduits dans la structure apo, influençant le site de liaison G6P (Figs. 3, 6, S4).

Notre hypothèse selon laquelle le G6P se lie en premier est encore renforcée par le fait que nous avons obtenu des cristaux uniquement en ajoutant du G6P (PDBID : 7ZHV) mais pas lors de la cristallisation avec le NADP+ seul. Par conséquent, les structures complexées uniquement avec le NADP+ ont toujours cristallisé sous catalyse. Par conséquent, le NADP+ lié pourrait également être le produit NADPH. Enfin, nous interprétons le décalage induit par G6P, conduisant à une rotation de 45° du domaine N et à une diminution de l'angle entre le domaine β-α et le domaine "Rossmann-like", comme un changement conformationnel vers la forme catalytique.

Fait intéressant, nous avons observé un réarrangement du site de liaison G6P lors de la liaison G6P. Dans les structures d'autres espèces, avec ou sans G6P lié, le site de liaison de G6P est similaire à nos structures avec G6P lié, mais pas aux structures LdG6PD sans G6P (Fig. 6b, d).

Cependant, la conformation G6P dans les structures LdG6PD est différente des G6PD homologues. Bien que le phosphate soit lié de la même manière, le cycle pyranose est tourné de 180 ° autour du phosphate et pointe donc dans la direction opposée (Fig. 5b). Dans cette conformation, l'anneau est situé dans un canal qui s'étend jusqu'au centre du tétramère (Fig. 3). Par conséquent, le transfert d'électrons avec NADP+ et donc la catalyse sont impossibles. Nous émettons l'hypothèse que cette conformation est une position d'attente de G6P, dont la position résulte soit de l'absence de NADP+ (PDBID : 7ZHV) soit est inhibée de la catalyse par le NADPH en tant que produit inhibiteur (PDBIDs : 7ZHW, 7ZHZ). Cependant, en tant que caractéristique du mécanisme postulé de Theorell-Chance, le complexe ternaire n'existe que pendant une très courte période, ce qui pourrait également expliquer pourquoi la véritable forme catalytique n'est visible dans aucune de nos structures.

La caractérisation cristallographique et biochimique de LdG6PD présentée dans cette étude a révélé une structure de G6PD trypanosomatide qui contient le domaine N complet, unique aux G6PD de la famille Kinetoplastida. Fait intéressant, nos recherches sur la fonction du domaine N hélicoïdal ont indiqué l'essentialité de la tétramérisation de LdG6PD et ont montré que le domaine N change de position lors de la liaison au substrat. Contrairement aux espèces homologues, nous avons observé des mouvements de domaine dépendants du G6P soutenus par des études cinétiques, révélant un mécanisme ordonné avec la liaison du G6P en premier, suivie du NADP+. Nous pensons que ces connaissances de LdG6PD contribueront de manière significative à la compréhension des mécanismes moléculaires des G6PD et fourniront une excellente base pour d'autres approches de découverte de médicaments.

Pour la surexpression hétérologue dans E. coli, les gènes codant wt LdG6PD (UniProt acc. n° A2CIL3) et LmG6PD (UniProt acc. n° Q4Q3K1) ont été commandés optimisés en codons auprès de BioCat GmbH (Heidelberg, Allemagne) et sous-clonés dans pET28a( +) vecteur utilisant les sites de restriction BamHI et HindIII, permettant ainsi des protéines marquées par His en N-terminal (tableau S2).

Pour caractériser la fonction potentielle du domaine N-terminal (couvrant les 49 premiers acides aminés), deux mutants ont été générés. C138 a été remplacé par de la sérine (LdG6PDC138S) en utilisant le kit de mutagenèse dirigée Q5® (New England Biolabs GmbH) avec la construction pET28a(+)-LdG6PD wt comme matrice. De plus, nous avons généré une construction tronquée dépourvue des 59 premiers acides aminés N-terminaux (LdG6PD60–562). La PCR a été réalisée en utilisant la polymérase Q5 et la construction pET28a(+)-LdG6PD wt utilisée comme matrice. Le produit de PCR a été purifié sur gel, digéré avec BamHI et HindIII et ensuite cloné dans le site BamHI-HindIII d'un vecteur pET28a(+). Toutes les amorces utilisées dans la présente étude sont décrites dans le tableau S3. Les constructions ont été vérifiées par séquençage à partir de LGC genomics (Berlin, Allemagne) à l'aide d'amorces standard dans le promoteur T7 et la séquence de terminaison T7 du vecteur pET28a(+).

Les plasmides d'expression codant pour LdG6PD et LmG6PD wt et les mutants correspondants ont été transformés dans des cellules E. coli C43 (DE3) à l'aide d'un vecteur pET28a(+). Les cellules avec le plasmide respectif ont été cultivées à 37 ° C dans un milieu de bouillon de lysogénie contenant 50 µg mL-1 de kanamycine. Lorsque la densité optique à 600 nm a atteint ~ 0, 5, une surexpression hétérologue a ensuite été induite pendant 4 h en ajoutant 0, 5 mM d'IPTG. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (15 min, 12 000 × g, 4 °C), mises en suspension dans du tampon A (500 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,8), mélangées avec des inhibiteurs de protéase (4 nM cystatine, 150 nM pepstatine, 100 µM PMSF) et stocké à -20 ° C jusqu'à la lyse. Pour la lyse cellulaire, du lysozyme et de la DNaseI ont été ajoutés à la suspension cellulaire et incubés pendant environ 12 h à 4 ° C, suivis de trois cycles de sonication et de centrifugation (30 min, 25 000 × g, 4 ° C). Le surnageant a été appliqué sur une colonne Ni-NTA pour la purification IMAC, pré-équilibrée avec le tampon A. Les protéines recombinantes marquées N-terminal His ont été éluées avec le tampon A contenant des concentrations croissantes (100 à 500 mM) d'imidazole. Les fractions contenant la protéine recombinante ont été regroupées et concentrées à l'aide d'une unité d'ultrafiltration (Vivaspin 20, filtre de coupure de 30 kDa ; Sartorius, Göttingen, Allemagne). Comme étape de purification supplémentaire et pour déterminer l'état d'oligomérisation des enzymes respectives, une chromatographie d'exclusion stérique (SEC) a été réalisée avec un système ÄKTA FPLC, en utilisant une colonne HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare, Fribourg, Allemagne) pré-équilibrée avec le tampon A. Pour étudier le comportement d'oligomérisation, la SEC a été réalisée dans des conditions natives, réductrices (5 mM DTT) et oxydatives (2 mM H2O2), ainsi qu'en présence de substrats (100 µM G6P, NADP+, G6P + NADP+ ). L'élution des protéines a été détectée à 280 nm et évaluée à l'aide du logiciel UNICORN 7.2. Les pics d'intérêt contenant la protéine recombinante ont été collectés et concentrés et la pureté de l'enzyme a été évaluée avec des gels SDS-PAGE colorés au bleu de Coomassie (polyacrylamide à 12 %). La concentration enzymatique a été déterminée en mesurant l'absorbance de la solution protéique à 260 et 280 nm à l'aide du Eppendorf BioSpectrometer (Hambourg, Allemagne), puis en calculant la concentration finale avec le poids moléculaire et le coefficient d'extinction des enzymes respectives (LdG6PD wt/LdG6PDC138S : 66,7 kDa, 63 113 M-1 cm-1 ; LdG6PD60–562 : 60,3 kDa, 61 623 M-1 cm-1 ; LmG6PD wt : 66,8 kDa, 63 175 M-1 cm-1). Après SEC, un rendement final de 0,5 à 2 mg de G6PD soluble, pur et actif par litre de culture d'E. coli a été obtenu pour toutes les protéines testées dans cette étude. Les enzymes sont restées stables pendant au moins 10 jours lorsqu'elles sont stockées à 4 ° C et 3 mois lorsqu'elles sont stockées à -80 ° C avec l'ajout d'AmSO4 250 mM, comme vérifié par des mesures d'activité enzymatique.

À l'aide du spectrophotomètre Evolution 300 (Thermo Scientific, Dreieich, Allemagne), l'activité G6PD a été déterminée à 25 °C en suivant la production de NADPH [ε340 = 6 220 M−1 cm−1] à 340 nm selon Beutler46. Toutes les réactions ont été réalisées dans le tampon B (50 mM Tris, 3,3 mM MgCl2, 0,005 % Tween, 1 mg mL−1 BSA, pH 7,5), tandis que les enzymes ont été pré-diluées dans le tampon C (50 mM Tris, 0,005 % Tween, 1 mg mL-1 SAB, pH 7,5). Le mélange réactionnel avec un volume final de 500 µL contenait 200 µM de NADP+, des concentrations variables des G6PD respectifs (0,95 à 1,3 nM) et 800 µM de G6P. Pour déterminer les valeurs apparentes de KM et Vmax, le substrat (1400–10 µM G6P) et le cosubstrat (500–2 µM NADP+) ont été variés réciproquement. Pour déterminer le mécanisme de la réaction, le G6P a été titré à différentes concentrations de NADP+ et vice versa. Toutes les mesures ont été effectuées au moins en triple, et les constantes cinétiques apparentes ont été calculées par régression non linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism 9.0.

Pour les études d'inhibition des produits, les taux initiaux ont été mesurés pour une série de concentrations de NADPH (0 à 80 µM) avec du G6P en saturation (800 µM) et des concentrations variables de NADP+ de 10 à 400 µM. De même, l'expérience a été réalisée en faisant varier la concentration de G6P de 20 à 1200 µM avec du NADP+ en saturation (200 µM) et à nouveau une série de concentrations de NADPH (0–80 µM). De manière analogue, du GlcN 6-P 0 à 20 µM a été utilisé comme inhibiteur couvrant les mêmes combinaisons et plages de concentrations de substrat que celles utilisées dans les expériences avec le NADPH.

Pour la cristallisation de LdG6PD wt et des mutants respectifs, LdG6PDC138S et LdG6PD60-562, les enzymes ont été concentrées à environ 10 mg mL-1 dans le tampon A. Des plaques de cristallisation ont été préparées à l'aide d'un robot de cristallisation Digilab Honeybee 961 générant des gouttes en mélangeant 0,2 µL de solution de réservoir avec 0,2 µL de solution protéique. Les cristaux de G6PD ont été cultivés dans un format à 96 puits avec la technique de diffusion de vapeur en goutte assise. Les conditions de cristallisation initiales ont été identifiées dans le criblage de la suite JCSG Core I (Quiagen) et optimisées en criblant autour des conditions initialement identifiées. Immédiatement après la préparation, les plaques ont été maintenues à 10 ° C car la croissance cristalline s'est déroulée très rapidement, entraînant des cristaux instables à faible résolution. Des cristaux appropriés n'ont pu être obtenus qu'en complexe avec le substrat et le cosubstrat (1 mM chacun). LdG6PD wt et LdG6PDC138S cristallisaient mieux dans un réservoir contenant 10 % de PEG 3000 et 100 à 150 mM d'AmSO4. Le mutant LdG6PD60–562 a cristallisé dans un réservoir contenant 6 % de PEG 3000 et 200 mM d'AmCl2 au lieu d'AmSO4.

Nous avons cristallisé séparément le dimère LdG6PD wt et la fraction tétramère. À partir de la fraction dimère, nous avons obtenu des cristaux complexés avec et sans NADP(H), avec G6P et avec G6P et NADP(H). A partir de la fraction tétramère, nous avons utilisé un cristal complexé avec NADP(H) et G6P. À partir de la fraction dimère du mutant LdG6PDC138S, nous avons obtenu des cristaux complexés avec NADP(H) et avec G6P et NADP(H). Pour le mutant de troncature LdG6PD60–562, nous avons obtenu des cristaux en complexe avec NADP(H) uniquement. Une condition préalable aux cristaux bien diffractants (<2 Å) était la présence des deux ligands, G6P et NADP + dans le tampon de cristallisation (tableau 2, tableau S1).

Les données de diffraction pour tous les cristaux ont été collectées sur la ligne de lumière X10SA (Pilatus 6 M pour les cristaux de LdG6PD wt et Eiger2 16 M pour les cristaux de mutants LdG6PD) de la source de lumière suisse à Villigen, Suisse à 100 K et traitées avec XDS47. Avant la collecte des données, les cristaux ont été trempés dans une liqueur mère avec une concentration finale de 35 % d'éthylène glycol.

L'apoenzyme (PDBID : 7ZHT) a cristallisé dans le groupe spatial P121 avec quatre monomères dans l'unité AU (tableau 2). L'enzyme wt en complexe avec G6P (PDBID : 7ZHV), l'enzyme wt et le mutant LdG6PDC138S en complexe avec NADP(H) (PDBID : 7ZHU, 7ZHY), ainsi qu'en complexe avec G6P et NADP(H) (PDBID : 7ZHW, 7ZHZ), cristallisé dans le groupe spatial C121 avec deux monomères dans l'UA. Toutes les structures complexées avec G6P ou NADP (H) présentent une symétrie de groupe d'espace C121, mais les structures avec G6P ont un axe a raccourci d'environ 5 Å. En plus des deux formes cristallines monocliniques (P121, C121), nous avons obtenu des cristaux orthorhombiques (C222) pour le mutant de troncature N-terminal LdG6PD60–562 (PDBID : 7ZHX) avec un monomère dans l'UA.

Un modèle de recherche de LdG6PD a été généré par modélisation d'homologie avec SWISS-MODEL48 en utilisant HsG6PD (PDBID : 5UKW) comme modèle. Le monomère LdG6PD modélisé comprend les résidus 70–549. Malgré l'identité de séquence élevée de 53% (Fig. S3), les tentatives de résolution de la structure de l'apoenzyme à l'aide du dimère G6PD canonique ont échoué. Au lieu de cela, une version tronquée du monomère LdG6PD modélisé a été utilisée, où les boucles à la surface, comprenant les résidus 170–179, 359–376, 471–480 et 546–549, ont été supprimées. La valeur Rfree initiale après le premier raffinement était de 37 %. L'UA de la solution finale contenait quatre monomères, qui forment deux dimères G6PD canoniques. Contrairement aux autres G6PD, LdG6PD contient un domaine N-terminal supplémentaire, qui n'était visible que dans un dimère de la structure apo. Les données de diffraction de tous les autres cristaux ont été mises en phase via des méthodes de remplacement moléculaire en utilisant la structure de l'apoenzyme. Au cours du raffinement, 8 % de toutes les réflexions pour les cristaux wt complexés avec le NADP(H) ont été omis et utilisés pour le calcul d'une valeur Rfree ; pour les autres cristaux, 10% de toutes les réflexions ont été utilisées. Les statistiques finales sont présentées dans le tableau 2.

Fait intéressant, la structure apo et toutes les structures complexées avec G6P ont une résolution beaucoup plus faible (≥ 2, 8 Å) que les structures dans lesquelles seul le NADP (H) est lié (≤ 1, 9 Å) (tableau S2). La densité électronique du noyau LdG6PD comprenant les résidus 5–470 et 483–552 est bien définie dans toutes nos structures. Dans certaines structures, la densité électronique du domaine N-terminal (domaine N), couvrant les 49 premiers résidus, est également bien définie, bien que les facteurs de température des atomes soient environ 1,5 fois supérieurs à la valeur moyenne des atomes du noyau. . Deux boucles comprenant les résidus D50-K64 et T471-D482 sont définies par la densité électronique dans certaines structures (tableau S1), mais le facteur B de ces résidus est au moins le double du facteur B moyen.

La suite de programmes PHENIX49,50 a servi au phasage de la réflexion et au raffinement de la structure. Le programme graphique interactif et Coot51 ont été utilisés pour la construction de modèles. Des images graphiques moléculaires ont été produites à l'aide du package UCSF Chimera52.

L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 9.0. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD. La reproductibilité a été confirmée en effectuant au moins deux déterminations indépendantes à partir de différents lots d'enzymes (pour la Fig. 1, Fig. S2) ou trois déterminations indépendantes avec différents lots d'enzymes, chacune comprenant au moins trois (pour le tableau 1) ou deux mesures (pour la Fig. 7 et Fig. S5) comme décrit dans la légende de la figure.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées et les amplitudes de réflexion mesurées ont été déposées dans la Worldwide Protein Data Bank RCSB PDB (http://pdb.org) : code 7ZHT pour LdG6PD wt sous sa forme apo ; code 7ZHU pour LdG6PD wt en complexe avec NADP(H); code 7ZHV pour LdG6PD wt en complexe avec G6P ; code 7ZHW pour LdG6PD wt en complexe avec NADP(H) et G6P ; code 7ZHX pour le mutant de troncature LdG6PD60–562 en complexe avec NADP(H) ; code 7ZHY pour le mutant LdG6PDC138S en complexe avec NADP(H) et 7ZHZ pour le mutant LdG6PDC138S en complexe avec NADP(H) et G6P. Toutes les données sources derrière les graphiques et les diagrammes et les analyses non traitées présentées dans les figures sont présentées dans les données supplémentaires 1.

OMS. Leishmaniose. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/leishmaniose (2021).

Burza, S., Croft, SL et Boelaert, M. Leishmaniose. Lancette 392, 951–970 (2018).

Article Google Scholar

Chakravarty, J. & Sundar, S. Médicaments actuels et émergents pour le traitement de la leishmaniose. Avis d'expert. Pharmacologue. 20, 1251-1265 (2019).

Article CAS Google Scholar

Roatt, BM et al. Progrès récents et nouvelles stratégies de traitement de la leishmaniose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 104, 8965–8977 (2020).

Article CAS Google Scholar

Loureiro, I. et al. Cibles médicamenteuses potentielles dans la voie des pentoses phosphates des trypanosomatidés. Courant. Méd. Chim. 25, 5239–5265 (2018).

Article CAS Google Scholar

Comini, MA, Ortíz, C. & Cazzulo, JJ Cibles médicamenteuses dans la voie des pentoses phosphates des trypanosomes et des leishmanies. In Trypanosomatid Diseases (édité par Jäger, T., Koch O. & Flohé L.) 297–313 (Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Allemagne, 2013).

Gupta, S., Igoillo-Esteve, M., Michels, PAM & Cordeiro, AT Glucose-6-phosphate déshydrogénase des trypanosomatides : caractérisation, validation de cible et découverte de médicaments. Mol. Biol. Int. 2011, 135701 (2011).

Article Google Scholar

Vonlaufen, N., Kanzok, SM, Wek, RC & Sullivan, WJ Voies de réponse au stress chez les parasites protozoaires. Cellule. Microbiol. 10, 2387–2399 (2008).

Article CAS Google Scholar

Krauth-Siegel, RL & Comini, MA Contrôle redox chez les trypanosomatides, protozoaires parasites avec métabolisme du thiol à base de trypanothione. Biochim. Biophys. Acta 1780, 1236-1248 (2008).

Article CAS Google Scholar

Kovářová, J. & Barrett, MP La voie des pentoses phosphates chez les trypanosomatides parasites. Tendances Parasitol. 32, 622–634 (2016).

Article Google Scholar

Leroux, AE, Maugeri, DA, Opperdoes, FR, Cazzulo, JJ & Nowicki, C. Études comparatives sur les propriétés biochimiques des enzymes maliques de Trypanosoma cruzi et Trypanosoma brucei. Microbiol FEMS. Lett. 314, 25–33 (2011).

Article CAS Google Scholar

Giordana, L. et al. Caractérisation moléculaire et fonctionnelle de deux enzymes maliques de parasites Leishmania. Mol. Biochimie. Parasitol. 219, 67-76 (2018).

Article CAS Google Scholar

Cordeiro, AT, Thiemann, OH & Michels, PAM Inhibition de la glucose-6-phosphate déshydrogénase de Trypanosoma brucei par des stéroïdes humains et leurs effets sur la viabilité des parasites cultivés. Bioorg. Méd. Chim. 17, 2483-2489 (2009).

Article CAS Google Scholar

Cordeiro, AT & Thiemann, OH La 16-bromoépiandrostérone, un activateur du système immunitaire des mammifères, inhibe la glucose 6-phosphate déshydrogénase de Trypanosoma cruzi et est toxique pour ces parasites cultivés. Bioorg. Méd. Chim. 18, 4762–4768 (2010).

Article CAS Google Scholar

Ortiz, C. et al. Glucose 6-phosphate déshydrogénase des trypanosomes : sélectivité pour les stéroïdes et validation chimique dans la circulation sanguine Trypanosoma brucei. Molécules 26, 358 (2021).

Solbach, W. & Laskay, T. La réponse de l'hôte à l'infection par la leishmanie. Dans Advances in Immunology, 1ère éd. Vol. 74 (édité par Dixon FJ) 275–317 (Elsevier textbooks, sl, 1999).

Moradin, N. & Descoteaux, A. Les promastigotes de Leishmania : construire une niche sûre dans les macrophages. Devant. Cellule. Infecter. Microbiol. 2, 121 (2012).

Article Google Scholar

Ghosh, AK et al. Reconfiguration métabolique du métabolisme central du glucose : une stratégie cruciale de Leishmania donovani pour sa survie lors d'un stress oxydatif. FASEB J. 29, 2081–2098 (2015).

Article CAS Google Scholar

Purkait, B. et al. Mécanisme de résistance à l'amphotéricine B dans les isolats cliniques de Leishmania donovani. Antimicrobien. Agents Chemother. 56, 1031-1041 (2012).

Article CAS Google Scholar

Sudhandiran, G. & Shaha, C. L'augmentation induite par l'antimoine du Ca2+ intracellulaire par des canaux cationiques non sélectifs chez l'hôte et le parasite est responsable de l'apoptose des amastigotes intracellulaires de Leishmania donovani. J. Biol. Chim. 278, 25120–25132 (2003).

Article CAS Google Scholar

Mishra, J. & Singh, S. La résistance à la miltefosine chez Leishmania donovani implique la suppression de la mort cellulaire programmée induite par le stress oxydatif. Exp. Parasitol. 135, 397–406 (2013).

Article CAS Google Scholar

Allen, SM et al. Plasmodium falciparum glucose-6-phosphate déshydrogénase 6-phosphogluconolactonase est une cible médicamenteuse potentielle. FEBS J. 282, 3808–3823 (2015).

Article CAS Google Scholar

Maloney, P. et al. Inhibiteur sélectif de la glucose-6-phosphate déshydrogénase de Plasmodium falciparum (PfG6PDH). Dans Probe Reports du NIH Molecular Libraries Program. (Bethesda (MD), 2010).

Haeussler, K. et al. Glucose 6-phosphate déshydrogénase 6-phosphogluconolactonase : caractérisation de l'enzyme Plasmodium vivax et études d'inhibiteurs. Malar. J. 18, 22 (2019).

Article Google Scholar

Berneburg, I. et al. Un composé principal de dihydrodibenzothiazépine optimisé (SBI-0797750) en tant qu'inhibiteur puissant et sélectif de Plasmodium falciparum et de P. vivax glucose 6-phosphate déshydrogénase 6-phosphogluconolactonase. Antimicrobien. Agents Chemother. 66, e0210921 (2022).

Article Google Scholar

Au, SWN, Gover, S., Lam, VMS & Adams, MJ Glucose-6-phosphate déshydrogénase humaine : la structure cristalline révèle une molécule NADP + structurelle et donne un aperçu du déficit enzymatique. Structure 8, 293–303 (2000).

Article CAS Google Scholar

Kotaka, M. et al. Études structurales de la liaison du glucose-6-phosphate et du NADP+ à la glucose-6-phosphate déshydrogénase humaine. Acta Crystallogr. Secte. D : Biol. Cristallologue. 61, 495-504 (2005).

Article Google Scholar

Mercaldi, GF, Dawson, A., Hunter, WN & Cordeiro, AT La structure d'une glucose-6-phosphate déshydrogénase de Trypanosoma cruzi révèle des différences par rapport à l'enzyme de mammifère. FEBS Lett. 590, 2776–2786 (2016).

Article CAS Google Scholar

Ortíz, C., Botti, H., Buschiazzo, A. & Comini, MA La glucose-6-phosphate déshydrogénase de l'agent pathogène humain Trypanosoma cruzi a développé des caractéristiques structurelles uniques pour soutenir la formation efficace du produit. J. Mol. Biol. 431, 2143-2162 (2019).

Article Google Scholar

Cleland, W. La cinétique des réactions catalysées par des enzymes avec deux ou plusieurs substrats ou produits. Biochim. Biophys. Acta 67, 104-137 (1963).

Article CAS Google Scholar

Levy, H., Christoff, M., Ingulli, J. & Ho, EM Glucose-6-phosphate déshydrogénase de Leuconostoc mesenteroides : mécanisme cinétique révisé et cinétique de l'inhibition de l'ATP. Cambre. Biochimie. Biophys. 222, 473–488 (1983).

Article CAS Google Scholar

Wang, X.-T., Au, SWN, Lam, VMS & Engel, PC Recombinant human glucose-6-phosphate déshydrogénase. Preuve d'un mécanisme d'ordre aléatoire à équilibre rapide. EUR. J. Biochem. 269, 3417–3424 (2002).

Article CAS Google Scholar

Jortzik, E. et al. Glucose-6-phosphate déshydrogénase-6-phosphogluconolactonase : une enzyme bifonctionnelle unique de Plasmodium falciparum. Biochimie. J. 436, 641–650 (2011).

Article CAS Google Scholar

Rowland, P., Basak, AK, Gover, S., Levy, H. & Adams, MJ La structure tridimensionnelle de la glucose 6–phosphate déshydrogénase de Leuconostoc mesenteroides raffinée à une résolution de 2,0 Å. Structure 2, 1073–1087 (1994).

Article CAS Google Scholar

Cohen, P. & Rosemeyer, MA Interactions des sous-unités de la glucose-6-phosphate déshydrogénase des érythrocytes humains. EUR. J. Biochem. 8, 8–15 (1969).

Article CAS Google Scholar

Wrigley, NG, Heather, JV, Bonsignore, A. & Flora, A. Glucose 6-phosphate déshydrogénase des érythrocytes humains : études au microscope électronique sur la structure et l'interconversion des tétramères, des dimères et des monomères. J. Mol. Biol. 68, 483–499 (1972).

Article CAS Google Scholar

Ranzani, AT & Cordeiro, AT Les mutations dans l'interface tétramère de la glucose-6-phosphate déshydrogénase humaine révèlent des différences cinétiques entre les états oligomères. FEBS Lett. 591, 1278-1284 (2017).

Article CAS Google Scholar

Glaser, TA, Baatz, JE, Kreishman, GP & Mukkada, AJ Homéostase du pH chez les amastigotes et promastigotes de Leishmania donovani. PNAS 85, 7602–7606 (1988).

Article CAS Google Scholar

Igoillo-Esteve, M. & Cazzulo, JJ La glucose-6-phosphate déshydrogénase de Trypanosoma cruzi : son rôle dans la défense du parasite contre le stress oxydatif. Mol. Biochimie. Parasitol. 149, 170-181 (2006).

Article CAS Google Scholar

Jiang, P. et al. p53 régule la biosynthèse par inactivation directe de la glucose-6-phosphate déshydrogénase. Nat. Cell Biol. 13, 310-316 (2011).

Article CAS Google Scholar

Ghosh, AK et al. L'interaction de la glucose-6-phosphate déshydrogénase et de la trypanothione réductase protège Leishmania donovani du stress oxydatif médié par les métalloïdes. Radic libre. Biol. Méd. 106, 10-23 (2017).

Article CAS Google Scholar

Ulusu, NN, Tandogan, B. & Tezcan, FE Propriétés cinétiques de la glucose-6-phosphate déshydrogénase du cortex rénal d'agneau. Biochimie 87, 187-190 (2005).

Article CAS Google Scholar

Guo, H., Han, J., Wu, J. & Chen, H. Hétéroexpression et caractérisation fonctionnelle de la glucose 6-phosphate déshydrogénase d'Aspergillus oryzae industriel. J. Microbiol. Biotechnol. 29, 577–586 (2019).

Article CAS Google Scholar

Tsai, CS & Chen, Q. Purification et caractérisation cinétique de l'hexokinase et de la glucose-6-phosphate déshydrogénase de Schizosaccharomyces pombe. Biochimie. Cellule. Biol. 76, 107-113 (1998).

Article CAS Google Scholar

Purich, DL Enzyme Kinetics. Catalyse & Contrôle ; a Reference of Theory and Best-Pratice Methods. 1ère éd. (Elsevier/AP, Amsterdam, 2010).

Beutler, E. Métabolisme des globules rouges. Un manuel de méthodes biochimiques. 3e éd. (Grune & Stratton, Orlando, 1984).

Kabsch, W. Intégration, mise à l'échelle, affectation de groupes spatiaux et post-raffinement. Acta Crystallogr. Secte. D : Biol. Cristallologue. 66, 133-144 (2010).

Article CAS Google Scholar

Waterhouse, A. et al. SWISS-MODEL : modélisation par homologie des structures et complexes protéiques. Nucleic Acids Res. 46, W296–W303 (2018).

Article CAS Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX : un système complet basé sur Python pour la solution de structure macromoléculaire. Acta Crystallogr. Secte. D : Biol. Cristallologue. 66, 213-221 (2010).

Article CAS Google Scholar

Moriarty, NW, Tronrud, DE, Adams, PD & Karplus, PA Une nouvelle bibliothèque de retenue par défaut pour le squelette protéique de Phenix : une géométrie dépendante de la conformation se généralise. Acta Crystallogr. Secte. D : Biol. Cristallologue. 72, 176-179 (2016).

Article CAS Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot : outils de création de modèles pour les graphiques moléculaires. Acta Crystallogr. Secte. D : Biol. Cristallologue. 60, 2126-2132 (2004).

Article Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera - un système de visualisation pour la recherche exploratoire et l'analyse. J. Comput. Chim. 25, 1605–1612 (2004).

Article CAS Google Scholar

Télécharger les références

Les auteurs tiennent à remercier Michaela Stumpf pour son excellente assistance technique. En outre, nous tenons à remercier Ilme Schlichting et Miroslaw Tarnawski pour la collecte de données soigneusement organisée. Les données de diffraction ont été recueillies sur la ligne de lumière X10SA, Swiss Light Source, Institut Paul Scherrer, Villigen, Suisse, et les auteurs remercient le personnel de la ligne de lumière pour l'excellente configuration. Le centre LOEWE DRUID (projets B3 et E3) du Hessian Excellence Program a soutenu ce travail.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Biochimie et biologie moléculaire, Centre de recherche interdisciplinaire, Université Justus Liebig, Giessen, Allemagne

Isabell Berneburg, Stefan Rahlfs, Katja Becker et Karin Fritz-Wolf

Institut Max Planck pour la recherche médicale, Heidelberg, Allemagne

Karin Fritz-Loup

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Conceptualisation (KB, KFW, IB); Conservation des données (IB, KFW) ; Analyse formelle (IB, KFW); Acquisition de financement (KB); Enquête (IB); Méthodologie (IB, KFW, SR); Ressources (KB, KFW); Logiciel (KFW); Supervision (KB, KFW); Validation (KFW, IB); Visualisation (IB); Rôles/Rédaction—ébauche originale (IB); Rédaction - révision et édition (KFW, IB, KB, SR).

Correspondance à Karin Fritz-Wolf.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : Gene Chong. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Berneburg, I., Rahlfs, S., Becker, K. et al. La structure cristalline de la glucose 6-phosphate déshydrogénase de Leishmania donovani révèle un domaine N-terminal unique. Commun Biol 5, 1353 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04307-7

Télécharger la citation

Reçu : 10 mai 2022

Accepté : 28 novembre 2022

Publié: 09 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04307-7

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.