Un comparatif multi - Série de sulfate de Harbin Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9306 (2023) Citer cet article

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Ici, une évaluation comparative de la toxicité des points de carbone précurseurs des déchets de café (cofCD) obtenus à l'aide des principes de la chimie verte et des nanohybrides dopés au Gd (cofNH) a été réalisée à l'aide d'essais hématologiques, biochimiques et histopathologiques in vivo (souris CD1, administration intrapéritonéale, 14 jours) , et approche neurochimique in vitro (terminaisons nerveuses du cortex de rat, synaptosomes). Les données biochimiques sériques ont révélé des changements similaires dans les groupes traités avec les cofCD et les cofNH, c'est-à-dire aucun changement dans les activités des enzymes hépatiques et la créatinine, mais une diminution des valeurs d'urée et de protéines totales. Les données hématologiques ont démontré une augmentation des lymphocytes et une diminution concomitante des granulocytes dans les deux groupes, ce qui pourrait mettre en évidence des processus inflammatoires dans l'organisme et a été confirmé par l'histopathologie hépatique ; diminution des paramètres associés aux globules rouges et du nombre de plaquettes, et augmentation du volume moyen des plaquettes, ce qui pourrait indiquer des problèmes de maturation des plaquettes et a été confirmé par l'histopathologie de la rate. Ainsi, l'innocuité relative des cofCD et des cofNH pour les reins, le foie et la rate a été démontrée, alors qu'il y avait des inquiétudes concernant la maturation plaquettaire et l'érythropoïèse. Dans une étude de neurotoxicité aiguë, les cofCD et les cofNH (0,01 mg/ml) n'ont pas affecté le niveau extracellulaire de L-[14C]glutamate et de [3H]GABA dans les préparations de terminaisons nerveuses. Par conséquent, les cofNH ont démontré des changements minimes dans les tests de biochimie et d'hématologie sériques, n'ont présenté aucun signe de neurotoxicité aiguë et peuvent être considérés comme un agent théragnostique non toxique biocompatible en perspective.

La combinaison de la modalité d'imagerie au sein de l'entité thérapeutique est une approche prometteuse pour surmonter les limites des traitements conventionnels, ce qui améliore finalement l'efficacité thérapeutique. Dans ce contexte, les nanomatériaux hybrides, les nanohybrides (NHs), suscitent un intérêt particulier en biomédecine, en raison de leurs propriétés physiques et chimiques particulières1. L'imagerie par résonance magnétique, IRM, est l'une des techniques de diagnostic par bioimagerie les plus répandues. Parmi les lanthanides, le meilleur agent de contraste pour le diagnostic IRM2 est le gadolinium (Gd) en raison de son moment magnétique élevé et de son temps de relaxation de spin électronique le plus long3, fournissant ainsi l'image IRM à contraste le plus fin. L'incorporation de Gd aux nanostructures permet d'une part d'atténuer sa toxicité dans l'organisme, et d'autre part permet d'exploiter un phénomène d'accumulation de nanoparticules dans la tumeur. Pour surmonter la toxicité, le Gd est généralement intégré dans les nanovésicules (par exemple les liposomes et les micelles), les nanoparticules métalliques et les nanomatériaux de carbone, etc.4,5,6,7,8,9.

Parmi les nanomatériaux de carbone, les points de carbone (CD) comprennent une grande diversité de classes de nanomatériaux qui présentent un intérêt particulier en raison de leur faible coût, de leurs méthodes de production simples, de leur faible impact environnemental et de leur potentiel d'application multidisciplinaire10, 11. Un avantage majeur de la production de CD est la perspective d'utiliser une variété de précurseurs et de méthodes12, et de plus, des CD peuvent être obtenus conformément aux principes de la chimie verte. Les approches méthodologiques de leur synthèse comprennent la pyrolyse assistée par micro-ondes, les méthodes hydrothermales électrochimiques, solvothermiques, etc.13. Aussi, selon les principes de la chimie verte, les biodéchets sont largement utilisés pour produire des CD, notamment la paille de blé14, les résidus de riz15, les graines de fenugrec16, les épluchures de fruits et légumes17,18,19,20, la mélasse de canne à sucre21, les déchets de café22,23,24, 25,26, etc. Les CD possèdent une composition défectueuse de sites aromatiques et aliphatiques coexistants, dont les constituants élémentaires sont le graphène, l'oxyde de graphène et le diamant, dont les proportions et les variations ainsi que la variété des groupes à leur surface dépendent de l'original matériaux et les conditions de leur synthèse.

Les CD ont montré une biotoxicité différente en fonction de leurs précurseurs et de leurs méthodes de production. Dans notre étude précédente, les propriétés neuroactives des CD obtenues à partir de β-alanine par chauffage aux micro-ondes ont été démontrées. Ces nanoparticules (à des concentrations élevées) ont affecté des caractéristiques clés de la neurotransmission inhibitrice et excitatrice, c'est-à-dire glutamate et acide g-aminobutyrique (GABA)-ergique, dans des terminaisons nerveuses isolées du cerveau de rat27. Il convient de souligner que le glutamate et le GABA sont des neurotransmetteurs excitateurs et inhibiteurs cruciaux, respectivement, dans le système nerveux central, dont le transport et l'homéostasie altérés contribuent au dysfonctionnement neuronal et à la pathogenèse des troubles neurologiques majeurs. Dans une autre étude, il a été révélé que les CD contenant du soufre synthétisées à partir de la thiourée présentent un tiers d'effets inférieurs sur le transport du glutamate et du GABA dans les terminaisons nerveuses par rapport aux CD sans soufre28.

Les données de la littérature ont montré que les CD synthétisés à partir de produits chimiques synthétiques commerciaux peuvent être dopés avec du Gd en utilisant un traitement hydrothermique énergétiquement défavorable29,30,31,32 et adopté une méthode assistée par micro-ondes33. Il y a un manque de données sur la toxicité des nanoparticules à base de carbone dopées au Gd. En particulier, la toxicité potentielle des CD dopés au Gd (Gd-CD) synthétisés via une technique sans solvant en une étape avec Gd-DTPA et L-arginine a été évaluée par analyse biochimique du sérum. Les Gd-CD ont démontré une faible toxicité pour les animaux dans une application à long terme34. Dans une autre étude, des Gd-CD ont été préparés en utilisant une méthode hydrothermale avec de l'acide 3,4-dihydroxyhydrocinnamique, de la 2,2′-(éthylènedioxy)bis(éthylamine) et du chlorure de gadolinium. Le test d'hémolyse des Gd-CD n'a montré aucun phénomène d'hémolyse significatif, indiquant ainsi un léger dommage aux globules rouges et une biocompatibilité avec le sang. Dans une étude de cytotoxicité utilisant des cellules rénales embryonnaires humaines (cellules T 293, test CCK-8), la viabilité cellulaire n'a pas été modifiée par les Gd-CD qui ont indiqué leur faible cytotoxicité in vitro. Les données d'histopathologie des tissus des souris traitées n'ont pas montré d'anomalies ou de lésions apparentes dans le cœur, les reins, le foie et la rate, par rapport aux groupes témoins. Il a été conclu que les Gd-CD présentaient une bonne biocompatibilité et convenaient à une bioapplication ultérieure31. En outre, la méglumine Gd a été utilisée avec de l'acide citrique et de la diéthylènetriamine pour synthétiser les Gd-CD par une méthode hydrothermale en une étape et les nanoparticules ont démontré une cytotoxicité discrète32. Des Gd-CD conjugués à des aptamères AS1411 ont été préparés via une approche solvothermique facile. Il n'y avait aucun dommage évident dans les cellules 4T1 par rapport au groupe témoin dans le test in vitro, aucune hémolyse évidente n'a été observée après l'application de nanoparticules in vivo et les nanoparticules synthétisées présentaient une bonne biocompatibilité35.

Comme le Gd possède en soi des caractéristiques biotoxiques36,37,38, la question s'est posée de savoir si le dopage au Gd contribuait ou non à la toxicité des nanoparticules. Il n'existe pas de données bibliographiques disponibles sur la toxicité comparative des Gd-CD et de leurs précurseurs non fonctionnalisés sans Gd.

Compte tenu des faits mentionnés ci-dessus, les objectifs de cette étude étaient : (*) une évaluation de la toxicité à plusieurs niveaux de nouveaux nanohybrides ultrapetits à base de carbone dopés au Gd à partir de déchets de café (cofNHs) obtenus sur la base de la chimie verte, et (* *) une comparaison de la toxicité des cofNHs avec leur précurseur, les CD sans Gd non fonctionnalisés provenant des déchets de café (cofCDs); par des approches méthodologiques hématologiques, biochimiques et histopathologiques après administration in vivo des nanoparticules, et étude de neurotoxicité aiguë in vitro. Ce dernier a caractérisé les effets comparatifs des cofCD et des cofNH sur la caractéristique cruciale de la neurotransmission glutamate- et GABA-ergique en utilisant des terminaisons nerveuses isolées du cortex de rat (synaptosomes), qui sont l'un des meilleurs systèmes modèles pour explorer les processus présynaptiques39.

Aucune toxicité n'a été observée dans aucun groupe d'animaux de laboratoire. La mortalité n'a pas non plus été observée dans les groupes contrôle et cofCD, cependant, 1 souris est décédée dans le groupe cofNH au 6ème jour de l'étude. De plus, tous les animaux sauf celui qui est mort ont démontré un gain de poids corporel consécutif sans différence statistiquement significative entre les groupes, ce qui pourrait suggérer le bien-être des souris et l'absence de toxicité des nanoparticules testées si elles sont appliquées aux doses décrites pendant 14 jours (Fig. 1).

Dynamique du poids corporel (changements absolus (a) et relatifs du poids corporel (b)) des souris témoins et de celles traitées avec des cofCD et des cofNH pendant 14 jours.

Selon les données présentées à la Fig. 2, l'application de cofCD et de cofNH a entraîné une tendance à l'augmentation du pourcentage de lymphocytes (LYM) (p = 0, 129 et p = 0, 071, respectivement) avec une diminution concomitante des pourcentages de granulocytes neutrophiles (GRAN) (p = 0,179 et p = 0,063, respectivement). Ces changements sont généralement la preuve d'un processus inflammatoire spécifique dans l'organisme, comme une infection bactérienne virale ou chronique, des troubles auto-immuns40. Cependant, s'il n'y a pas de changement dans le nombre absolu de globules blancs, nous pourrions supposer plutôt un changement de réponse immunitaire, mais pas une véritable inflammation. L'augmentation du LYM% peut avoir lieu en cas de troubles auto-immuns à la suite de la stimulation des lymphocytes. En effet, et les CD pourraient avoir un tel impact41. Par conséquent, nous suggérons que les changements observés pourraient mettre en évidence un certain changement dans la réponse immunitaire contre les nanoparticules testées. Cependant, nous voudrions remarquer que les valeurs observées étaient toujours dans la plage normale typique pour les souris CD-142.

Paramètres hématologiques des souris témoins et de celles traitées avec des cofCD et des cofNH pendant 14 jours au jour terminal de l'étude. *p < 0,05, **p < 0,01.

Le nombre d'érythrocytes (RBC) et les paramètres associés (valeurs d'hémoglobine (HGB), d'hématocrite (HCT) et de concentration corpusculaire moyenne d'hémoglobine (MCHC)) ont démontré une diminution des valeurs pour les cofCD et les cofNP de la même manière. Une diminution des RBC, HGB, HCT et MCHC pourrait mettre en évidence une inhibition de l'érythropoïèse, et Gd ne contribue probablement pas à ce processus. Ensuite, une augmentation du volume plaquettaire moyen (MPV) avec une diminution concomitante du nombre de plaquettes (PLT) dans les deux groupes pourrait mettre en évidence l'altération du processus de maturation des plaquettes, et, encore une fois, Gd n'est pas censé être le principal contributeur à cela. Dans l'ensemble, il existe des preuves d'inflammation et de violation de l'érythropoïèse et de la formation de plaquettes, et il semble que le noyau de carbone soit le principal contributeur à ces processus, et Gd n'ajoute aucune toxicité supplémentaire à cela.

Selon les données présentées à la Fig. 3, il n'y a pas de changements significatifs dans les activités des enzymes hépatiques, ce qui ne pourrait mettre en évidence aucun impact substantiel des cofCD et des cofNP sur la fonction hépatique43. Diminution de l'urée dans les groupes traités par cofCD et cofNH avec une tendance à la diminution des protéines totales (p = 0,147 et p = 0,129, respectivement). Ces données pourraient mettre en évidence une carence en protéines dans l'organisme en raison d'un apport insuffisant en protéines ou d'une malabsorption, ou de certains problèmes de synthèse et de métabolisme des protéines, qui se produisent tous deux dans le foie44. Comme les souris de tous les groupes ont continuellement pris du poids tout au long de l'étude (Fig. 1), la malnutrition peut donc être exclue. Ainsi, la raison de la diminution de l'urée dans le sérum pourrait être une conséquence d'un métabolisme protéique altéré. Il convient de noter, cependant, que malgré les changements significatifs par rapport au contrôle, les valeurs d'urée sérique se situaient dans la plage normale, typique des souris CD-142.

Paramètres biochimiques sériques des souris témoins et de celles traitées avec des cofCD et des cofNH pendant 14 jours au jour terminal de l'étude. **p < 0,01 par rapport au contrôle.

L'absence de modifications de la concentration sérique de créatinine ne pourrait mettre en évidence aucun impact sur la fonction rénale. Pris ensemble, les cofCD et les cofNP pourraient entraîner une inhibition de la synthèse des protéines, mais ces nanoparticules à des doses appliquées n'ont causé aucune violation substantielle des fonctions hépatique et rénale.

Selon les données histopathologiques présentées dans les tableaux 1, 2 et 3 et sur la figure 4, les cofCD et les cofNH n'ont pas affecté de manière substantielle les états du foie, des reins et de la rate de cette manière, ce qui pourrait être considéré comme une lésion. Cependant, il y avait encore quelques changements structurels. Ainsi, les cofCD et les cofNH ont induit de légers signes inflammatoires dans le foie, se manifestant par une légère accumulation de cellules de Kupffer dans tout le tissu et des locus d'accumulation occasionnels de leucocytes, ce qui est conforme à nos découvertes hématologiques. Dans le groupe traité par cofNH, une congestion des vaisseaux sanguins a parfois également eu lieu.

Microphotographies des reins, du foie et de la rate de souris témoins et de celles traitées avec des cofCD et des cofNH. Grossissement ×100, H&E. Échelle 100 µm.

Dans les reins, une légère perte de bordure en brosse de l'épithélium tubulaire a été observée dans les groupes traités au cofCD et au cofNH, ce qui n'a cependant pas eu d'impact sur la fonction rénale, comme en témoignent les taux sériques de créatinine et d'urée. De plus, une légère hyperplasie tubulaire a eu lieu dans ces deux groupes, qui, bien que survenant au cours d'une néphropathie progressive chronique, est considérée comme le signe d'une prolifération des cellules tubulaires et d'une régénération des tubules45. Ainsi, on a pu conclure que les reins étaient affectés par les composés testés, mais se régénéraient avec succès. Ensuite, dans le groupe traité par cofNH, une dilatation des vaisseaux sanguins a parfois eu lieu, ce qui est similaire à la découverte dans le foie, et pourrait mettre en évidence une certaine altération de l'apport sanguin de ces organes.

Les changements histopathologiques dans la rate étaient similaires chez les souris traitées avec cofCD et cofNP. Une hyperplasie de la zone marginale (légère) et une mégacaryocytose avec augmentation du nombre de mégacaryocytes (de légère à modérée) ont été observées, ainsi que des locus nécrotiques occasionnels. L'hyperplasie de la zone marginale pourrait mettre en évidence une certaine activation du système phagocytaire en raison du fait qu'elle est principalement peuplée de macrophages45. Nos données sur l'accumulation potentielle de nanoparticules dans la rate sont conformes à la littérature46, 47. La mégacaryocytose est fréquente en cas de violation de la maturation et de la différenciation plaquettaires48, ce qui confirme notre suggestion basée sur les résultats hématologiques.

Ainsi, une sécurité relative des cofCD et des cofNH pour les reins, le foie et la rate pourrait être suggérée. Cependant, il y avait quelques inquiétudes concernant la maturation des plaquettes et l'érythropoïèse, ainsi qu'un léger processus inflammatoire dans le foie causé principalement par le noyau de carbone. Néanmoins, ces changements étaient minimes et pourraient donc ne pas constituer un obstacle pour plusieurs applications cofCD ou cofNHs. Ensuite, une forte capture de Gd par le noyau cofCD pourrait être conclue en raison de l'absence de différences dans les valeurs biochimiques, hématologiques et histopathologiques dans les groupes traités par cofCD et cofNH.

Le potentiel de membrane a été contrôlé à l'aide du colorant fluorescent sensible au potentiel rhodamine 6G. Fst, l'indice de potentiel de membrane au niveau de l'état d'équilibre, a été atteint pendant 5 min, et il a été fixé à 100 % dans les calculs statistiques. Dans les expériences fluorimétriques illustrées sur les figures 5a, b, il a été révélé que les cofCD et les cofNH ne modifiaient pas le potentiel membranaire des terminaisons nerveuses et ne dépolarisaient donc pas leur membrane plasmique. Pour comparer, l'évolution temporelle de la dépolarisation membranaire induite par le KCl (35 mM) des terminaisons nerveuses a été présentée à la Fig. 5.

Expériences de fluorescence : Le potentiel membranaire des terminaisons nerveuses en présence de cofCDs et cofNHs. ( a ) La suspension de synaptosomes a été équilibrée avec du colorant sensible au potentiel rhodamine 6G (0, 5 mM); lorsque le niveau stable de la fluorescence du colorant a été atteint, le SSS (le contrôle), les cofCD (0,01 mg/ml), les cofNH (0,01 mg/ml) et le KCl (35 mM) (marqués par la flèche) ont été ajoutés aux synaptosomes . Les traces sont typiques et représentent 12 expériences réalisées avec différentes préparations de synaptosomes. ( b ) Une augmentation du signal de fluorescence de la rhodamine 6G en réponse à l'application de cofCD (0, 01 mg / ml), de cofNH (0, 01 mg / ml) et de KCl (35 mM). Les données sont la moyenne ± SEM. ***, p < 0,001 par rapport au témoin ; ns, pas de différences significatives ; n = 12.

Les transporteurs de glutamate et de GABA dépendants du Na+ sont des acteurs stratégiques dans la neurotransmission synaptique, médiant l'absorption des neurotransmetteurs dans le cytoplasme des terminaisons nerveuses présynaptiques et établissant le niveau extracellulaire approprié des neurotransmetteurs. Ce dernier est un paramètre synaptique crucial qui représente un équilibre dynamique dépendant de l'énergie entre les valeurs de l'absorption médiée par le transporteur et la fuite non stimulée des neurotransmetteurs49, 50.

Comme le montre le tableau 4, le taux extracellulaire de L-[14C]glutamate dans les préparations de terminaisons nerveuses n'a pas été modifié par les cofCD et les cofNH à une concentration de 0,01 mg/ml.

Comme le montre le tableau 5, le taux extracellulaire de [3H]GABA dans les préparations de terminaisons nerveuses n'a pas été significativement modifié par les cofCD et les cofNH à une concentration de 0,01 mg/ml. Ces résultats sont conformes aux données ci-dessus sur le L-[14C]glutamate. Cependant, il convient de noter que les cofNH avaient une forte tendance à augmenter le niveau extracellulaire synaptosomique de [ 3 H] GABA à cette concentration.

Dans la série suivante d'expériences, il a été évalué les effets de Gd3+ sur le niveau extracellulaire de L-[14C]glutamate et de [3H]GABA dans des préparations de terminaisons nerveuses. Il a été constaté que le Gd3+ à des concentrations de 1 et 10 µM de Gd3+ lié à sa teneur en cofNH ne modifiait pas de manière significative le niveau extracellulaire de L-[14C]glutamate et de [3H]GABA dans les préparations de terminaisons nerveuses (tableau 6). Cependant, il convient de noter que le Gd3+ à une concentration de 10 µM avait une forte tendance à augmenter le niveau extracellulaire des synaptosomes à la fois en L-[14C]glutamate et en [3H]GABA.

Ici, une évaluation comparative de la toxicité générale et de la neurotoxicité aiguë des cofCD et des cofNH a été réalisée dans des expériences in vivo et in vitro, respectivement. Les résultats de la biochimie sérique n'ont révélé aucun changement dans les principales enzymes hépatiques, ce qui n'a pu mettre en évidence aucune toxicité substantielle contre cet organe, cependant, certains signes inflammatoires ont été observés. Une diminution de l'urée dans les deux groupes ainsi qu'une tendance à la diminution de TP pourraient mettre en évidence une inhibition de la synthèse des protéines. Pris ensemble, les deux composés aux doses appliquées n'ont provoqué aucune violation substantielle des fonctions hépatique et rénale. Les données hématologiques ont démontré une augmentation du LYM % et une diminution concomitante du GRAN % dans les deux groupes, ce qui pourrait mettre en évidence un processus inflammatoire dans l'organisme et a confirmé nos résultats histopathologiques dans le foie. Une diminution (significative ou tendancielle) des RBC, HGB, HCT et MCHC dans les groupes cofCD- et cofNH- pourrait mettre en évidence une inhibition de l'érythropoïèse, et Gd y a à peine contribué ; une augmentation du MPV avec une diminution concomitante du PLT pourrait mettre en évidence l'altération du processus de maturation des plaquettes, ce qui est conforme aux résultats histopathologiques dans la rate. Dans l'ensemble, il y avait des preuves d'inflammation et de violation de l'érythropoïèse et de la formation de plaquettes. Comme presque aucune différence dans les valeurs biochimiques, hématologiques et histopathologiques dans le groupe traité par cofNH n'a été observée par rapport à celui traité par cofCD, nous avons pu conclure que le noyau cofCD contribue probablement beaucoup à ces processus.

Nos données expérimentales sur la toxicité générale des cofNHs sont conformes aux données de la littérature. En particulier, la toxicité potentielle des Gd-CD et du Gd-DTPA (agent de contraste largement utilisé) a été comparée chez des souris ayant reçu une injection de Gd-CD (concentration de Gd de 5 mg/kg) et de Gd-DTPA via la veine caudale. Dans l'analyse biochimique du sérum sanguin, les échantillons de sang ont été prélevés pendant une période de 1 à 21 jours. Il a été révélé que les Gd-CD présentaient un effet similaire par rapport au Gd-DTPA. L'analyse des indicateurs rénaux, de l'azote uréique sanguin et de la créatinine n'a pas révélé de différence entre le groupe témoin et le groupe Gd-CD, démontrant ainsi l'absence de dommages à la fonction rénale. Dans l'analyse de la fonction hépatique, les valeurs d'AST et d'ALT ont été légèrement augmentées après 1 jour d'injection. Les indicateurs hépatiques, albumine et protéines totales, ont été maintenus à un niveau normal. Les Gd-CD et le Gd-DTPA peuvent affecter la fonction hépatique peu de temps après l'injection sans endommager significativement les tissus hépatiques, car le foie pourrait récupérer rapidement sa fonction après 7 jours d'injection. Pris ensemble, ces résultats ont démontré une faible toxicité des Gd-CD et du Gd-DTPA pour les animaux34. Dans une autre étude, l'hémolyse n'a pas été révélée après l'administration de Gd-CD (préparés à l'aide d'une méthode hydrothermale avec de l'acide 3,4-dihydroxyhydrocinnamique, de la 2,2′-(éthylènedioxy)bis(éthylamine) et du chlorure de Gd), montrant ainsi peu de dommages au rouge cellules sanguines et biocompatibilité avec le sang. L'analyse histologique des organes après 24 h après l'injection de Gd-CD dans une étude de toxicité in vivo n'a révélé aucun dommage évident dans les groupes traités par Gd-CD, tels qu'une réponse inflammatoire, une fibrose pulmonaire, une nécrose ou des dommages aux principaux organes. La toxicité à long terme in vivo sur un modèle de souris Kunming saines pendant 16 jours a révélé que les Gd-CD n'induisaient pas de troubles hépatiques ou rénaux évidents chez les souris sur la base de l'évaluation de TP, ALT, AST, ALP, azote uréique sanguin, cholestérol total et triglycérides . L'histopathologie des souris traitées avec Gd-CDs n'a révélé aucune anomalie ou lésion histopathologique apparente observée dans le cœur, les reins, le foie et la rate, par rapport au témoin. Aucun signe de nécrose n'a été révélé dans les échantillons histologiques. Dans les tissus pulmonaires, des infiltrats cellulaires péribronchiques et périvasculaires ont été mis en évidence, indiquant des réponses inflammatoires pulmonaires modérées. Il a été conclu que les Gd-CD présentaient une bonne biocompatibilité in vivo et pouvaient convenir à une bioapplication ultérieure31. Aucun phénomène d'hémolyse n'a été observé en étudiant l'hémocompatibilité des Gd-CDs conjugués aux aptamères AS1411 (AS1411-Gd-CDs). Il a été conclu que les AS1411-Gd-CD possédaient la merveilleuse biocompatibilité quant à l'application dans le domaine biologique35.

Dans une étude de neurotoxicité aiguë in vitro, les cofCD n'ont pas affecté les niveaux ambiants de L-[14C]glutamate et de [3H]GABA dans les préparations de terminaisons nerveuses à une concentration de 0,01 mg/ml. Les CofNH n'affectent pas le niveau extracellulaire de L-[14C]glutamate, mais ont tendance à augmenter celui de [3H]GABA à cette concentration. L'évaluation de la contribution de Gd a révélé que les ions Gd3+ à des concentrations apparentées ne présentaient aucun changement significatif, mais avaient tendance à augmenter les niveaux extracellulaires des deux neurotransmetteurs dans les préparations de terminaisons nerveuses. Bien que les cofNH n'aient pas été en mesure d'atténuer la neurotoxicité du Gd à cette concentration (les deux ne sont pas toxiques), la présence de Gd incorporé dans la structure du cofNH permet à Gd de s'accumuler dans la tumeur dans une application biomédicale basée sur le phénomène de nanoparticules d'accumulation tumorale. Les résultats de neurotoxicité de CofCD coïncident avec nos expériences précédentes sur des CD à des concentrations similaires obtenues à partir de β-alanine et de CD contenant du soufre à partir de thiourée et d'acide citrique27, 28. En particulier, les CD de β-alanine à des concentrations de 0,01 mg/ml n'ont pas influencé la niveau extracellulaire de L-[14C]glutamate et de [3H]GABA dans les préparations de terminaisons nerveuses27. Les CD contenant du soufre provenant de la thiourée et de l'acide citrique n'ont également eu aucun effet sur le niveau extracellulaire des synaptosomes des deux neurotransmetteurs28.

Les données de neurotoxicité aiguë in vitro sur les CofNH sont conformes aux données de la littérature. Dans l'étude de cytotoxicité in vitro utilisant des cellules rénales embryonnaires humaines (cellules T 293) et le test CCK-8, Gd-CD (préparé par méthode hydrothermale avec de l'acide 3,4-dihydroxyhydrocinnamique, 2,2′-(éthylènedioxy)bis(éthylamine) et chlorure de Gd) même à une concentration élevée de 1 mg/mL n'ont pas modifié la viabilité cellulaire après 24 h d'incubation, ce qui indique leur faible cytotoxicité in vitro31. Dans une autre étude, il a été montré que les Gd-CD obtenus par une méthode hydrothermale en une étape avaient une cytotoxicité discrète32. En particulier, en utilisant les cellules NIH3T3 et 4T1 et le test CCK-8, il a été montré que les cellules conservaient une viabilité élevée après 24 h de coincubation, indiquant ainsi que les Gd-CD conjugués aux aptamères AS1411 induisaient une toxicité négligeable35.

En perspective, nous prévoyons d'optimiser les approches méthodologiques et de réaliser une étude de neurotoxicité aiguë à des concentrations significativement plus élevées (de 50 fois) de cofCD et de cofNH pour confirmer ou non si la tendance à l'augmentation du niveau extracellulaire de [3H]GABA dans les préparations de terminaisons nerveuses par les cofNHs ( Tableau 4) a entraîné une augmentation significative de ce paramètre. En effet, une concentration relativement faible de cofCD et de cofNH a été appliquée dans des expériences in vitro (par rapport à notre précédente étude liée au CD27, 28) en raison du manque de transparence et de la couleur brune de ces nanoparticules. Les concentrations d'ions Gd3 + liées aux nanoparticules (tableau 5) appliquées aux terminaisons nerveuses n'étaient pas non plus élevées. Néanmoins, ces concentrations de nanoparticules sont liées aux concentrations de cofCD et de cofNH utilisées dans l'étude animale in vivo et sont applicables à l'imagerie IRM potentielle chez les animaux. La capacité possible des cofNH à augmenter le niveau extracellulaire de [ 3 H] GABA dans les préparations de terminaisons nerveuses peut être utilisée comme caractéristique théranostique neurochimique supplémentaire. Théoriquement, un composé qui n'affecte pas le niveau ambiant de glutamate mais qui augmente le niveau ambiant de GABA dans les terminaisons nerveuses peut posséder des effets antiépileptiques, sédatifs et hypnotiques.

EGTA, EDTA, HEPES, Ficoll 400, Sigma-Fluor® High Performance LSC Cocktail, les sels de qualité analytique ont été achetés auprès de Sigma (USA) ; Le L-[14C]glutamate et le [3H]GABA (acide y-[2,3-3H(N)]-aminobutyrique) provenaient de Perkin Elmer (Waltham, MA, USA). La rhodamine 6G a été obtenue auprès de Molecular Probes (USA).

La synthèse « verte » assistée par micro-ondes de cofCDs et cofNHs à partir de déchets de café a été réalisée selon une technique similaire à celle décrite dans l'étude51 avec des étapes de purification supplémentaires. En particulier, 5 g de coulis de café ont été imbibés d'une solution de GdCl3 0,1 M, séchés, imbibés d'une solution de NH4OH à 10 % et frittés 10 min au four à micro-ondes dans un ballon à fond rond de 250 ml sous air, permettant de procéder simultanément à l'ammoxydation réactions et interaction des fragments hydrolysés entre eux grâce aux réactions de Maillard, condensation aldol, alkylation des phénols, déshydratation des glucides, etc. Les atomes de gadolinium peuvent être retenus par des groupements carboxyliques ainsi que par des groupements hydroxyles des dérivés de l'acide hydroxycinnamique abondants dans le café52, 53. Ensuite, les nanoparticules ont été remises en suspension dans de l'eau distillée, filtrées à travers des concentrateurs Vivaspin 20® avec des membranes en polyéthersulfone (PES) de différentes tailles de pores pour obtenir une fraction inférieure à 30 kDa de poids moléculaire, dialysées à travers une membrane de 3 500 MWCO (ZelluTrans ROTH® Regenerated Cellulose Tubular Membrane), et préconcentré à l'aide de Vivaspin 20® de 3 000 MWCO pour obtenir des nanoparticules dans la gamme 3–30 kDa. Leurs propriétés physiques et chimiques ont été partiellement caractérisées54, ainsi que des images TEM (voir Fig. S1) et des spectres FTIR (Fig. S2) sont fournis dans les informations supplémentaires.

Des souris femelles CD1, âgées de 10 à 11 semaines, avec un poids corporel initial de 19,6 ± 3,0 g ont été utilisées dans l'étude. Les animaux ont été gardés dans l'animalerie de l'Université nationale Taras Shevchenko de Kiev sous un éclairage naturel à 20–23 ° C, et un accès gratuit à un régime alimentaire standardisé pour rongeurs et à de l'eau du robinet. Toutes les expériences ont été menées conformément aux principes de bioéthique, aux normes législatives et aux dispositions de la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et à d'autres fins scientifiques55, Principes éthiques généraux applicables aux expériences sur les animaux, adoptés par le premier Congrès national de bioéthique (Kiev, 2001), et approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (Protocole #1, 24 juin 2021).

Des animaux (rats Wistar, mâles, âgés de 12 semaines, poids corporel d'environ 120 g) ont été gardés dans les animaleries de l'Institut Palladin de biochimie, Académie nationale des sciences d'Ukraine, alimentés ad libitum avec de l'eau et un régime standardisé pour rongeurs, et logés dans une pièce à température contrôlée à 22–23 °C. Les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux directives de la Communauté européenne (2010/63/UE) et aux lois/politiques locales, et ont été approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Institut Palladin de biochimie (protocole n° 1 du 21 septembre 2010). 2020). Toutes les études animales ont été rapportées conformément aux directives ARRIVE pour les expériences impliquant des animaux56, 57. Le nombre total de rats utilisés dans l'étude était de 12, en particulier, les mesures des niveaux extracellulaires de L-[14C]glutamate et [3H] GABA dans les terminaisons nerveuses − 12 animaux ; et les expériences de fluorimétrie ont partagé ces 12 animaux.

Les souris ont été réparties au hasard dans 3 groupes de traitement (n = 5 dans chacun) et ont reçu des cofCD et des cofNH dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 25,0 mg/ml, ou du PBS pur (groupe témoin) par voie intrapéritonéale au volume de 5 ml/ kg (ce qui correspond à des doses de cofCDs et de cofNHs de 125 mg/kg chacune) quotidiennement pendant 14 jours consécutifs, selon les recommandations pour les études de toxicité à doses répétées pour le développement préclinique de médicaments58, 59. Au 15ème jour de l'étude, les souris ont été anesthésiées par 2,2,2-tribromoéthanol (250 mg/kg) et sacrifiés par dislocation cervicale.

L'état général et le poids corporel des souris ont été surveillés quotidiennement. L'état externe de la peau et du pelage, des yeux, des muqueuses, du système respiratoire, de la posture et des modifications de l'activité spontanée a été évalué. Le système de notation détaillé est présenté dans le tableau 7. Les observations ont été effectuées immédiatement après la première administration, et une fois par jour pendant la période d'observation.

Le sang pour l'analyse hématologique a été recueilli immédiatement après le sacrifice par ponction cardiaque, 25 µl de sang frais ont été transférés dans des tubes avec un volume égal de solution de K2EDTA à 0,4 % dans une solution saline. L'évaluation des paramètres hématologiques a été réalisée à l'aide de l'analyseur d'hématologie MCL-3124 (Guangzhou Mecan Trading Co., Ltd, Chine) et des réactifs consommables Cormay (Pologne) dans les deux heures suivant le prélèvement sanguin. Numération des globules blancs (GB), lymphocytes (LYM), cellules de taille moyenne (monocytes, éosinophiles et basophiles, MID), valeurs absolues et relatives des neutrophiles (GRAN), numération des érythrocytes (RBC), hémoglobine (HGB), hématocrite ( HCT), la numération plaquettaire (PLT) et le volume moyen (MPV) ont été mesurés.

Le sang pour analyse biochimique a été prélevé immédiatement après le sacrifice par ponction cardiaque, laissé pendant 60 min pour former un caillot de fibrine, puis centrifugé à 5400 g pendant 20 min à 4 °C. Le sérum sanguin a été prélevé et utilisé immédiatement pour déterminer la valeur de l'alanine aminotransférase (ALT), de l'aspartate aminotransférase (AST), de la γ-glutamyl transpeptidase (GGT), de la lactate déshydrogénase (LDH), de la phosphatase alcaline (ALP), de l'urée, de la créatinine et de protéines totales (TP). Les analyses ont été effectuées sur un analyseur de chimie entièrement automatique MF-240 (MedFuture LLC, USA) en utilisant des kits de réactifs standard (Cormay, Pologne) selon les protocoles fournis par le fabricant.

Des échantillons de foie, de rein et de rate ont été prélevés immédiatement après le sacrifice et fixés dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 7 jours. Après fixation au formol, les échantillons ont été déshydratés dans des solutions d'éthanol et inclus dans de la paraffine, coupés pour obtenir des lames de 5 µm d'épaisseur, qui ont été déparaffinées et colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) selon les méthodes standard60, et examinées au microscope optique par pathologiste qui ne connaissait pas les groupes de traitement. Les caractéristiques pathologiques ont été évaluées de manière semi-quantitative, les systèmes de notation détaillés sont présentés dans le tableau 8.

La région cérébrale du cortex isolée de rats décapités a été immédiatement retirée, puis homogénéisée dans la solution saline glacée contenant du saccharose 0, 32 M, HEPES – NaOH 5 mM, pH 7, 4 et EDTA 0, 2 mM. Une préparation de synaptosomes a été obtenue à partir d'un rat, et chaque mesure a été effectuée en triple exemplaire. Les préparations de synaptosomes ont été obtenues en utilisant des centrifugations différentielles et en gradient de densité Ficoll-400 d'homogénat de cerveau de rat selon 61, 62, 63. Les préparations de synaptosomes ont été utilisées dans les expériences pendant 2 à 4 h. La solution saline standard (SSS) contenait (en mM) : NaCl 126 ; KCl 5; MgCl2 2,0; NaH2PO4 1,0 ; HEPES 20, pH 7,4; D-glucose 10. La concentration en protéines a été examinée selon64.

Les préparations de synaptosomes ont été diluées dans le SSS pour atteindre une concentration de 2 mg de protéine/ml, et après une pré-incubation à 37 °C pendant 10 min ont été chargées avec du L-[14C]glutamate (2,81 μM, 1 μCi/ml) dans le SSS à 37 ° C pendant 10 min. Après la procédure de chargement, les suspensions de synaptosomes ont été lavées avec 10 volumes de SSS glacé ; les culots ont été remis en suspension dans le SSS pour atteindre une concentration finale de 1 mg de protéine/ml. Des suspensions de synaptosomes (125 μl ; 0,5 mg de protéine/ml) ont été pré-incubées à 37 °C pendant 10 min, puis les aliquotes de cofCDs et cofNHs ont été ajoutées et incubées avec des synaptosomes pendant 10 min, puis sédimentées à l'aide d'une microcentrifugeuse (20 s à 10 000 g). Le niveau extracellulaire de L-[14C]glutamate a été enregistré dans les aliquotes de surnageants (100 μl) et de culots en utilisant un comptage par scintillation liquide avec Sigma-Fluor® High Performance LSC Cocktail (1,5 ml) et un compteur à scintillation liquide Hidex 600SL (Finlande), et les valeurs ont été exprimées en pourcentage du L-[14C]glutamate de synaptosome total accumulé65, 66. Les données sur le L-[14C]glutamate ont été recueillies en triple à partir de plusieurs (n) expériences indépendantes réalisées avec différentes préparations de synaptosomes.

Les préparations de synaptosomes ont été diluées dans le SSS jusqu'à 2 mg de protéine/ml, et après leur pré-incubation à 37 °C pendant 10 min ont été chargées avec [3H]GABA (50 nM, 4,7 µCi/ml) dans le SSS pour 10 minutes. L'acide aminooxyacétique inhibiteur de la GABA transaminase à une concentration de 100 µM a été utilisé pendant les expériences de chargement et de libération de [3H]GABA pour minimiser la formation de métabolites du GABA. Après chargement, les suspensions de synaptosomes ont été lavées avec 10 volumes de SSS glacé. Les culots ont été remis en suspension dans le SSS pour avoir une concentration en protéine de 1 mg/ml. Les suspensions de synaptosomes (120 µl) ont été pré-incubées à 37 °C pendant 10 min, puis les aliquotes de cofCD et de cofNH ont été ajoutées et incubées pendant 10 min, et sédimentées à l'aide d'une microcentrifugeuse (20 s à 10 000 g). Le niveau extracellulaire de [3H]GABA dans les préparations de synaptosomes a été enregistré. La radioactivité du [3H]GABA a été mesurée dans les aliquotes de surnageants (90 µl) par comptage à scintillation liquide avec Sigma-Fluor® High Performance LSC Cocktail (1,5 ml) et un compteur à scintillation liquide Hidex 600SL (Finlande), et les valeurs ont été exprimées en pourcentage du synaptosome total accumulé [3H]GABA67. Les données [3H]GABA ont été recueillies en triple exemplaire à partir de plusieurs (n) expériences indépendantes réalisées avec différentes préparations de synaptosomes.

Le potentiel membranaire des synaptosomes en présence de cofCD et de cofNH a été mesuré à l'aide du colorant fluorescent potentiométrique rhodamine 6G (0,5 µM) sur la base de sa liaison dépendante du potentiel aux membranes68,69,70. La suspension de synaptosomes (une concentration finale de 0,2 mg de protéine/ml) a été préincubée à 37°C pendant 10 min, puis ajoutée à une cuvette thermostatée sous agitation continue. La suspension de synaptosomes a été équilibrée avec la sonde et les aliquotes de cofCD et de cofNH ont été ajoutées. Pour estimer les changements dans le potentiel de membrane plasmique, le rapport (F) en tant qu'indice de potentiel de membrane a été calculé selon l'équation : F = Ft/F0, où F0 et Ft sont les intensités de fluorescence d'un colorant fluorescent en l'absence et en présence du synaptosomes, respectivement. F0 a été calculé par extrapolation de la fonction de décroissance exponentielle à t = 0. Les mesures de fluorescence avec la rhodamine 6G ont été effectuées à l'aide d'un spectrofluorimètre Hitachi MPF-4 à des longueurs d'onde de 528 nm (excitation) et 551 nm (émission) (bandes fendues de 5 nm chacune).

Le logiciel GraphPad Prism 9.0.0 a été utilisé pour l'analyse statistique et la visualisation des données. L'homogénéité de la variance a été évaluée à l'aide du test de Levene. Les données expérimentales ont été exprimées comme la moyenne ± SEM de n expériences indépendantes. La différence entre les deux groupes a été comparée par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test post hoc de Tukey. Le test U de Mann-Whitney pour des échantillons indépendants a été utilisé pour l'analyse des scores de signes histopathologiques. Les différences étaient considérées comme significatives lorsque p < 0,05.

Une étude de toxicité à court terme (14 jours d'administration) a été réalisée, ce qui ne permet pas de tirer une conclusion stricte sur l'absence de toxicité retardée des produits chimiques testés. Cependant, comme l'objectif principal des nanomatériaux dopés au Gd est l'application de la bioimagerie, c'est-à-dire l'administration unique, les termes utilisés dans cette étude de toxicité permettent au moins d'exclure la toxicité aiguë des nanoparticules, et pourraient donc être une base pour mener des recherches animales précliniques sur ces nanoparticules. chimiques pendant l'administration à long terme.

En résumé, une évaluation comparative de la toxicité à plusieurs niveaux a montré une sécurité relative des cofCD et des cofNH pour les reins, le foie et la rate. Il y avait quelques inquiétudes concernant la maturation des plaquettes et l'érythropoïèse, ainsi que l'affection potentielle du foie, mais l'incorporation de Gd n'était probablement pas liée à cela. Au total, les cofNH ont démontré des changements minimes dans les tests de biochimie et d'hématologie sériques qui ne constituent pas un obstacle à l'application biomédicale des cofNH. De plus, les cofCD et les cofNH n'ont pas influencé les niveaux extracellulaires de L-[14C]glutamate et de [3H]GABA dans les préparations de terminaisons nerveuses, et n'ont donc présenté aucun signe de neurotoxicité aiguë. Dans l'ensemble, on peut considérer que les cofNH peuvent être analysés plus en détail dans la recherche biomédicale en tant qu'agent théragnostique de perspective.

Les ensembles de données utilisés au cours de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. En partie, des données sur la synthèse des nanoparticules sont disponibles dans les Actes du C'Nano 2023 : The Nanoscience Meeting ; Poitiers, 2023 ; p. 24.

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Cette recherche a été financée par le programme d'échange de personnel de recherche et d'innovation (RISE) de l'UE Horizon 2020 dans le cadre de l'action Marie Skłodowska-Curie (projet 101008159 "UNAT"), et subvention de la Fondation nationale de la recherche d'Ukraine, projet n ° 2021.01/0061 (AP, MD , TB − évaluation de la neurotoxicité des nanoparticules de carbone obtenues par chauffage de composés organiques).

Corporation Science Park, Université Taras Shevchenko de Kiev, 60 Volodymyrska Str., Kiev, 01033, Ukraine

Halyna Kuznietsova, Natalia Dziubenko, Konstantin Paliienko, Tetiana Lysenko, Valeriy Skryshevsky & Tatiana Borisova

Institut des hautes technologies, Université nationale Taras Shevchenko de Kiev, rue Volodymyrska, 64, Kiev, 01601, Ukraine

Halyna Kuznietsova, Natalia Dziubenko et Valeriy Skryshevsky

Institut Palladin de biochimie Académie nationale des sciences d'Ukraine, 9 rue Leontovicha, Kiev, 01054, Ukraine

Konstantin Paliienko, Natalia Pozdnyakova, Natalia Krisanova, Artem Pastukhov, Tetiana Lysenko, Marina Dudarenko et Tatiana Borisova

Light Matter Institute, UMR-5306, Claude Bernard University of Lyon/CNRS, Université de Lyon, 69622, Villeurbanne Cedex, France

Vladimir Lyssenko

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Conceptualisation, TB, VL, VS, HK, ND ; Méthodologie, KP, VL, HK, ND, NP, NK, AP, TL, MD, TB ; Analyse formelle, TB, HK, ND, NP, NK ; Enquête, KP, HK, ND, NP, NK, AP, MD ; Conservation des données, KP, VL, TB, HK, ND, NP, NK ; Rédaction—Préparation de l'ébauche originale, CT ; Supervision, VS, LV, TB ; Rédaction—Révision et édition, TB, HK, ND, NP, KP,VS ; Acquisition de financement, VS, VL Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance à Konstantin Paliienko.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Kuznietsova, H., Dziubenko, N., Paliienko, K. et al. Une évaluation comparative de la toxicité à plusieurs niveaux de points sans Gd à base de carbone et de nanohybrides dopés au Gd provenant de déchets de café : étude d'hématologie, de biochimie, d'histopathologie et de neurobiologie. Sci Rep 13, 9306 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36496-4

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Reçu : 03 avril 2023

Accepté : 05 juin 2023

Publié: 08 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36496-4

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