Production d'acide muconique à partir de glucose et de xylose chez Pseudomonas putida via l'évolution et l'ingénierie métabolique

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4925 (2022) Citer cet article

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L'acide muconique est une molécule bioprivilégiée qui peut être convertie en produits chimiques de remplacement direct pour les produits pétrochimiques en place et les bioproduits performants. Dans cette étude, Pseudomonas putida KT2440 est conçu pour convertir le glucose et le xylose, les principaux glucides des hydrolysats lignocellulosiques, en acide muconique en utilisant une stratégie guidée par un modèle pour maximiser le rendement théorique. En utilisant l'évolution adaptative en laboratoire (ALE) et l'ingénierie métabolique dans une souche conçue pour exprimer la voie de la D-xylose isomérase, nous démontrons que des mutations dans le symporteur hétérologue D-xylose: H + (XylE) augmentent l'expression d'un transporteur majeur de la superfamille des facilitateurs (PP_2569 ), et la surexpression d'aroB codant pour la 3-déshydroquinate synthase native, permettent une production efficace d'acide muconique à partir de glucose et de xylose simultanément. En utilisant la souche de conception rationnelle, nous produisons 33,7 g de muconate L-1 à 0,18 g L-1 h-1 et un rendement molaire de 46 % (92 % du rendement théorique maximum). Cette stratégie d'ingénierie est prometteuse pour la production d'autres composés dérivés de la voie shikimate à partir de sucres lignocellulosiques.

Le développement de procédés économiques pour la production de biocarburants et de produits biochimiques à partir de la lignocellulose sera essentiel pour aider à réduire les émissions anthropiques de gaz à effet de serre associées à la consommation de combustibles fossiles1,2. Parmi les différentes zones de l'espace métabolique qui ont été explorées pour la production biochimique, les molécules issues des voies cataboliques aromatiques microbiennes présentent une diversité chimique importante3,4. Il convient de noter que l'acide cis,cis-muconique (ci-après muconate) est une plate-forme chimique populaire de la voie catabolique catéchol qui peut être produite à partir de composés aromatiques dérivés de la lignine, de glucides et de composés aromatiques dérivés de déchets plastiques5,6,7,8,9 ,10,11,12. Le muconate est une molécule bioprivilégiée13 qui peut être convertie en produits chimiques de remplacement direct, tels que l'acide adipique et l'acide téréphtalique5,14,15, ou convertie en bioproduits à performance améliorée16,17,18,19,20,21,22,23,24 .

La production de muconate à partir d'hydrates de carbone est basée sur la voie du shikimate pour la biosynthèse des acides aminés aromatiques et a été démontrée pour la première fois dans Escherichia coli recombinant5. L'érythrose-4-phosphate (E4P) et le phosphoénolpyruvate (PEP) sont condensés pour former le 3-désoxy-d-arabinoheptulosonate 7-phosphate (DAHP), qui est ensuite converti en 3-déshydroshikimate (3-DHS), un intermédiaire clé dans le voie shikimate. À partir du 3-DHS, au moins cinq voies ont été signalées pour la biosynthèse des muconates25,26,27,28,29,30. Parmi ces voies, l'une passe par le protocatéchuate intermédiaire (PCA) via une 3-DHS déshydratase (asbF) et aboutit à un rendement théorique maximum plus élevé que les autres, qui passent par le shikimate via une shikimate déshydrogénase (aroE) (Fig. 1a )29.

a Schéma de la stratégie globale d'ingénierie métabolique. Pour utiliser le xylose, le xylE, la d-xylose isomérase (xylA), la xylulokinase (xylB), la transaldolase (tal) et la transcétolase (tkt) d'E. coli ont été exprimées de manière hétérologue. E4P et PEP ont été condensés pour former du DAHP via une DAHP synthase résistante à la rétroaction (aroGD146N)70. Pour convertir le DAHP en muconate (MA), des gènes codant pour une 3-DHS déshydratase (asbF) de Bacillus cereus, et une PCA décarboxylase (aroY) et sa protéine génératrice de cofacteur correspondante (ecdB), toutes deux d'Enterobacter cloacae, ont été hétérologues exprimée. aroB et la catéchol 1,2-dioxygénase (catA) étaient surexprimées3,32. Une chorismate pyruvate-lyase modifiée de E. coli (ubiC-C22)40 a été surexprimée pour convertir le chorismate (CSA) en 4-hydroxybenzoate (4HB), qui peut être converti en PCA et MA. Les gènes supprimés sont indiqués en rouge. La glucose déshydrogénase (gcd) a été supprimée pour empêcher la formation de xylonate ou de gluconate. Les isomérases de glucose-6-phosphate pgi-1 et pgi-2 ont chacune été supprimées précédemment3,32, mais pgi-1 a été restauré dans cette étude. Les pyruvate kinases pykA et pykF ont chacune été supprimées pour réduire la compétition pour le PEP. Pour accumuler MA, pcaHG et catBC ont été supprimés pour empêcher l'ouverture du cycle de PCA et le catabolisme de MA, respectivement. P phosphate, 2-KGn 2-cétogluconate, 2-KG-6-P 2-cétogluconate-6-P, G6P glucose-6-P, 6PG 6-phosphogluconate, KDPG 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate, G3P glycéraldéhyde-3-P, FBP fructose-1,6-P2, F6P fructose-6-P, S7P sédoheptulose-7-P, R5P ribose-5-P, Ri5P ribulose-5-P, 3PG 3-phosphoglycérate, CAT catéchol, SA shikimate, S3P shikimate-3-phosphate, ICIT isocitrate, CIT citrate, AKG alpha-cétoglutarate, SUCC succinate, FUM fumarate, MAL malate, GLX glyoxylate, OAA oxaloacétate, AcCoA acétyl-Coenzyme A. b Modélisation métabolique du maximum rendements molaires et carbonés théoriques en muconate avec ou sans pgi-1. Les lignes bleues représentent la voie asbF, les lignes rouges représentent la voie aroE, les lignes pleines représentent le % de rendement molaire et les lignes pointillées représentent le % de rendement en carbone. Les zones grises représentent le pourcentage molaire de xylose consommé de 33 à 40% (avec le solde glucose), mimant la composition des hydrolysats de tiges de maïs. c Cultures en flacon agité de la souche QP328 sur glucose et xylose. Le % de rendement molaire a été calculé comme [mM muconate/mM (glucose + xylose) × 100], et le % de rendement en carbone a été calculé comme [mM muconate × 6/mM (glucose × 6 + xylose × 5) × 100]. Les barres d'erreur représentent l'écart type des triplicats biologiques. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Plusieurs efforts antérieurs pour produire du muconate à partir de sucres via asbF ont perturbé la voie du shikimate en supprimant aroE10,11,31. La suppression d'aroE donne des souches auxotrophes pour les acides aminés aromatiques essentiels, ce qui n'est pas souhaitable pour un bioprocédé10,25. Récemment, des souches de Pseudomonas putida KT2440 (ci-après P. putida) ont été conçues pour produire efficacement du muconate à partir de glucose via asbF3,32,33. Plus récemment, nous avons rapporté l'ingénierie de P. putida qui a atteint un titre de 22,0 g L-1 à 0,21 g L-1 h-1 et un rendement molaire de 35,6 % à partir de glucose dans un bioréacteur à pH contrôlé32.

À ce jour, la plupart des efforts pour produire du muconate à partir d'hydrates de carbone ont utilisé le glucose comme substrat. Cependant, la co-utilisation du glucose et du xylose, qui sont souvent les deux principaux glucides de la lignocellulose2, est cruciale pour la valorisation des hydrolysats de biomasse. La co-utilisation du glucose et du xylose pour la production de muconate a été étudiée chez Escherichia coli11. Dans ces travaux antérieurs, le xylose a été métabolisé en cycle TCA pour éviter la répression des catabolites de carbone (CCR), limitant ainsi le rendement en muconate, ce qui motive le développement d'autres stratégies vers cet objectif. Contrairement à E. coli, P. putida est nativement incapable d'utiliser le xylose, ce qui offre la possibilité de concevoir des voies de xylose optimales en l'absence de CCR34,35,36,37.

Dans ce travail, nous cherchons à incorporer l'utilisation du xylose pour obtenir une production efficace de muconate à partir de glucose et de xylose chez P. putida. À cette fin, nous supprimons d'abord hexR et concevons la voie D-xylose isomérase dans une souche précédemment conçue pour produire du muconate à partir de glucose (tableau 1). En combinant la modélisation métabolique, l'ingénierie rationnelle des souches, l'évolution adaptative en laboratoire et la culture en bioréacteurs, nous identifions des stratégies efficaces pour améliorer la production de muconate à partir de glucose et de xylose. Enfin, la métabolomique est réalisée pour déduire l'impact des modifications génétiques sur le flux métabolique.

Trois voies métaboliques du xylose ont été considérées pour permettre la production de muconate à partir de ce substrat36, y compris la voie de l'isomérase dans laquelle le xylose est métabolisé en xylulose-5-P (X5P) dans la voie des pentoses phosphates (PPP)38, la voie de Weimberg qui alimente xylose au cycle TCA via l'α-cétoglutarate38,39, et la voie de Dahms40, qui partage les trois étapes initiales avec la voie de Weimberg, après quoi le semialdéhyde α-cétoglutarique est converti par une aldolase en pyruvate et glycolaldéhyde. Parmi celles-ci, la voie de la d-xylose isomérase, dans laquelle le xylose est métabolisé via la d-xylose isomérase (xylA) et la xylulokinase (xylB) en xylulose-5-phosphate (X5P), est idéale pour atteindre un rendement théorique élevé en muconate puisque X5P peut être ensuite converti en E4P et ensuite entrer dans la voie du shikimate (Fig. 1a)35. Nous avons intégré la voie de l'isomérase dans une souche précédemment conçue pour produire du muconate à partir de glucose, CJ5223, en surexprimant des versions optimisées en codons de la d-xylose isomérase (xylA), de la xylulokinase (xylB) et du symporteur d-xylose:H+ d'E. coli (xylE), ainsi qu'une transaldolase (tal) et une transcétolase (tkt) pour améliorer le flux de carbone au sein du PPP (Fig. 1a)35. Nous avons également supprimé hexR, qui code pour un régulateur transcriptionnel qui contrôle l'expression de gènes importants pour le métabolisme du sucre, car nous avions précédemment découvert que cela améliorait la conversion du glucose en muconate32.

Thompson et al. précédemment rapporté que l'utilisation des voies asbF et aroE peut aider à maximiser l'assimilation nette des précurseurs et le flux de métabolites vers le muconate25. Ainsi, une chorismate pyruvate-lyase (ubiC-C22)41 modifiée avec une inhibition de produit soulagée a été intégrée pour améliorer la production de muconate par la voie du shikimate via aroE (Fig. 1a). Nous avions précédemment supprimé pgi-1 et pgi-2, qui codent pour les glucose-6-P isomérases redondantes, pour perturber le cycle EDEMP, une combinaison des voies Entner-Doudoroff, gluconéogène Embden-Meyerhoff-Pernass et les voies des pentoses phosphates42. Le but de perturber le cycle EDEMP est de l'empêcher de cycler pour générer du pyruvate indépendant du PEP lors de la croissance sur glucose, ce qui pourrait permettre à la cellule de rediriger le carbone vers la croissance au détriment de la production de muconate, malgré la suppression des gènes codant pour les pyruvate kinases (pykA, pykF) et PEP carboxylase (ppc)3. Cette stratégie est bénéfique pour la production de muconate à partir de glucose comme seule source de carbone, mais dans ce cas, la suppression de pgi-1 et pgi-2 diminuerait le rendement théorique maximal en muconate des voies de biosynthèse du muconate catalysées par asbF et aroE lorsque le xylose est converti via le PPP (Fig. 1b).

Considérant que la fraction de xylose dans le mélange de glucose et de xylose (xylose/glucose + xylose%, moles) dans l'hydrolysat de canne de maïs varie de 34 à 38% (Fig. 1 supplémentaire), la modélisation a prédit un rendement théorique maximal de muconate avec pgi- 1 et pgi-2 supprimés pour être plus bas que si l'un ou les deux sont présents (Fig. 1b). Pour tester l'hypothèse selon laquelle l'activité glucose-6-phosphate isomérase (codée par pgi-1 et pgi-2) est nécessaire pour que le flux de xylose entre dans le cycle EDEMP, nous avons construit des souches basées sur JE322635, une souche dérivée de P. putida KT2440 qui a été précédemment conçu pour utiliser le xylose en utilisant la voie de la d-xylose isomérase, mais il est par ailleurs de type sauvage, générant les souches LC041 (∆pgi-1), LC345 (∆pgi-2), LC347 (∆pgi-1 ∆pgi-2). Dans la culture du lecteur de plaques sur un milieu M9 contenant du xylose, LC347 n'a pas réussi à se développer, tandis que LC041 et LC345 ont présenté des taux de croissance réduits et des retards de croissance accrus (Fig. 2 supplémentaire). LC345, avec pgi-1 intact, présentait un taux de croissance plus faible et un retard de croissance plus long par rapport à LC041, qui ne contient que pgi-2, ce qui suggère que Pgi-1 contribue moins à l'activité globale de la glucose-6-phosphate isomérase que Pgi-2. Étant donné que le cycle EDEMP devrait entrer en compétition avec la biosynthèse du muconate et réduire le rendement en muconate, nous avons ainsi restauré pgi-1 pour permettre le flux de xylose dans le cycle EDEMP et améliorer le rendement théorique maximal, générant la souche QP328 (Fig. 1a et Tableau 1) .

La souche QP328 a été cultivée dans des flacons agités sur un mélange de glucose et de xylose pour examiner leur conversion en muconate. Bien que la voie de la xylose isomérase se soit avérée efficace chez P. putida35 de type sauvage, le taux d'utilisation du xylose de QP328 était cependant très faible par rapport à celui du glucose (Fig. 1c). Étant donné que le glucose et le xylose peuvent être utilisés simultanément dans le contexte de type sauvage de P. putida KT2440 lors de l'introduction de la même voie de la xylose isomérase, nous avons émis l'hypothèse qu'un goulot d'étranglement dans le transport ou le métabolisme du xylose était présent dans notre souche productrice de muconate.

Pour améliorer l'utilisation du xylose par QP328, nous avons effectué une ALE par passage en série de la souche sur un milieu M9 additionné de xylose 10 mM comme seule source de carbone et d'énergie. Au fur et à mesure que les populations subissaient des passages, des valeurs de DO600 plus élevées étaient atteintes plus rapidement. Après 7 passages (~ 50 générations), les quatre lignées ont atteint la turbidité en 2 à 4 jours contre 14 jours au début de l'ALE, et l'évolution s'est terminée. Les populations évoluées des quatre lignées ont été étalées sur une plaque de gélose LB, et trois isolats sur chaque plaque ont été choisis pour le pré-criblage en flacon agité (12 isolats au total). Dans la plupart des cas, tous les triplicats de la même lignée présentaient une croissance et une production de muconate similaires, il a donc été supposé qu'ils représentaient probablement le même génotype et un seul de chaque lignée a été conservé. Dans la lignée 1, cependant, un réplicat s'est comporté différemment, donc deux isolats ont été conservés (Fig. 3 supplémentaire). Pour identifier les mutations susceptibles de contribuer à une meilleure utilisation du xylose, les génomes des cinq isolats ont été séquencés. Les cinq isolats présentaient des mutations dans le transporteur de xylose xylE (A62V, A62V et A455V, T34I, L214P, S205F, pour les isolats 1, 2, 3, 4, 5, respectivement). Quatre des isolats (1, 3-5) avaient des mutations qui ont probablement inactivé aroG-D146N (décalage de cadre +7 pb, décalage de cadre +2 pb, M1N et L2H, décalage de cadre -16 pb, pour les isolats 1, 3, 4, 5, respectivement ) (Fig. 2a). Les cinq isolats ont ensuite été évalués dans des flacons agités sur du glucose, du xylose et un mélange de glucose et de xylose. Comme prévu, les souches avec des mutations dans aroG-D146N se sont mieux développées mais ont produit moins de muconate. L'isolat 2 a obtenu le rendement en muconate le plus élevé et le rendement en biomasse le plus faible et a été désigné QP478 (Fig. 4 supplémentaire). QP478 a démontré une croissance considérablement améliorée sur le xylose par rapport à QP328 dans un lecteur de plaques, dans lequel la croissance de QP328 était négligeable tandis que QP478 atteignait une DO600 de 0, 5 en 72 h (Fig. 2b).

a Mutations identifiées dans l'ALE par séquençage du génome entier des cinq isolats (le diagramme de Sankey a été construit à l'aide de l'outil en ligne SankeyMATIC). b Courbe de croissance des souches rétro-conçues LC091 et LC100, avec la souche non évoluée QP328 et la souche évoluée QP478 à titre de comparaison. μA représente le taux de croissance absolu, et tous les μA présentés ici sont les valeurs moyennes de trois courbes de croissance indépendantes. c Expériences en flacon agité des souches rétro-conçues LC091 et LC100, comparées à QP478, sur un milieu M9 additionné de xylose 30 mM. Le rendement de LC100 a été comparé à LC091 en utilisant le test t de Student bilatéral (P < 0,0001). d Expériences en flacon agité comparant les souches rétro-conçues LC091 et LC100 et la souche évoluée QP478 sur un milieu M9 additionné de glucose 30 mM et de xylose 15 mM. Le % de rendement molaire a été calculé comme [mM muconate/mM (glucose + xylose) × 100], et le % de rendement en carbone a été calculé comme [mM muconate × 6/mM (glucose × 6 + xylose × 5) × 100]. Les barres d'erreur représentent ici l'écart type de trois répétitions biologiques. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les mutations identifiées dans QP478 sont répertoriées dans les données supplémentaires 1. Parmi celles-ci, les mutations que nous avons supposées pourraient être liées à l'amélioration de la croissance sur le xylose, notamment : (1) deux mutations faux-sens dans le gène du transporteur de xylose, xylE, où les résidus d'alanine ont été remplacés par des valines , A62V et A455V ; (2) une mutation ponctuelle G → A à 10 pb en amont de l'élément −35 d'un promoteur putatif (Fig. 5 supplémentaire) prédite par le programme de prédiction du promoteur BPROM σ7043 en amont de PP_2569, qui est annotée comme une superfamille de facilitateurs majeurs de métabolites ( MFS) transporteur dans la base de données Uniprot ; et (3) une région de 227,8 kB du génome de PP_5050 à PP_5242 qui semblait être dupliquée (Fig. 2a).

Pour comprendre la contribution des mutations qui ont conduit à une croissance améliorée sur le xylose pendant l'ALE, nous avons créé des souches qui ont restauré individuellement les séquences de type sauvage dans la souche évoluée QP478. Les mutations A62V et A455V ont été restaurées au type sauvage séparément dans xylE, générant respectivement LC093 et ​​LC078. La mutation G→A dans la région promotrice de PP_2569 a été restaurée, générant LC061. Dans les expériences de lecture de plaques, la restauration de xylE-A455V ou de xylE-A62V a entraîné une diminution du taux de croissance et un retard de croissance accru de LC078 et LC093, respectivement (Fig. 6a – c supplémentaires). La restauration de la mutation G → A dans PPP_2569 a entraîné une légère diminution du taux de croissance (Fig. 6a, b supplémentaires). Dans les flacons agités, seul LC093 a démontré un rendement en muconate significativement inférieur à celui de QP478 (Fig. 6f, g, j supplémentaires), mais les trois souches LC061, LC078 et LC093 ont présenté une croissance et une production de muconate plus lentes (Fig. 6g – j supplémentaires). ce qui est cohérent avec les résultats des expériences du lecteur de plaque (Fig. 6a – c supplémentaires). La productivité réduite du muconate, causée par une diminution des taux de croissance et / ou un retard de croissance accru, a indiqué que toutes ces mutations contribuaient à l'amélioration de la croissance cellulaire sur le xylose de QP478 (Fig. 6 supplémentaire).

Nous avons également réalisé l'expérience inverse, en incorporant les mutations ALE dans la souche parente QP328 pour obtenir une souche conçue de manière rationnelle contenant uniquement des mutations qui contribuent à l'amélioration de la production de muconate. Nous avons d'abord procédé à l'ingénierie inverse de la souche non évoluée QP328 avec les trois mutations ponctuelles. Les mutations A62V et A455V XylE ont été introduites dans la souche non évoluée QP328, générant LC091. La mutation G→A dans PPP_2569 a été conçue dans QP328 et LC091, générant respectivement LC092 et LC100. Les souches LC091, LC092 et LC100, ainsi que QP328 et QP478, ont été évaluées dans un lecteur de plaque contenant du milieu M9 avec 30 mM de xylose. Fait intéressant, l'introduction des deux mutations XylE a permis la croissance cellulaire sur le xylose dans LC091 (Fig. 2b), qui présentait un taux de croissance comparable mais une biomasse finale plus élevée par rapport à QP478 sur le xylose seul et un mélange de xylose et de glucose (Fig. 2b). L'introduction de la mutation G → A dans PPP_2569 à QP328 a également permis la croissance cellulaire de LC092 sur le xylose, bien qu'à un taux beaucoup plus faible par rapport à LC091 (Fig. 2b). De manière inattendue, l'introduction de la mutation G → A dans PPP_2569 à LC091 a entraîné une diminution de la croissance et une diminution de la biomasse de LC100 sur les substrats de xylose et mixtes (Fig. 2b).

Nous avons ensuite évalué LC091, LC100 et QP478 dans des flacons agités contenant du milieu M9 avec 30 mM de xylose. LC091 a atteint presque le double du rendement en biomasse (OD600) mais a obtenu un rendement en muconate inférieur à celui de QP478 (Fig. 2c). De plus, LC100 a atteint un rendement en muconate comparable à QP478, mais à un taux inférieur (Fig. 2c). La RT-qPCR a indiqué que la mutation G → A dans PPP_2569 augmentait l'expression de PP_2569 (Fig. 7 supplémentaire). Nous avons également évalué LC091, LC100 et QP478 sur milieu M9 avec un mélange de glucose et de xylose. Conformément aux résultats sur le xylose uniquement, le rendement en muconate de LC091 est inférieur à LC100 et QP478 sur le mélange ; LC100 présentait toujours une croissance beaucoup plus lente que QP478 sur le mélange, bien qu'il utilisait simultanément du glucose et du xylose et atteignait un rendement en muconate comparable (Fig. 2d). La différence entre ces souches suggère qu'un gène ou des gènes dans la région dupliquée PP_5050 – PP_5242 pourraient être importants pour l'amélioration des performances de QP478.

La seule différence génétique entre les souches LC091 et LC100 est la mutation G → A dans la région promotrice qui a conduit à une expression plus élevée d'un transporteur MFS putatif PP_2569 (Fig. 5 supplémentaire). Pour rationaliser la façon dont la mutation pourrait se produire dans l'ALE et pour examiner comment le métabolisme pourrait être affecté par PP_2569, des expériences de métabolomique intracellulaire et extracellulaire ont été menées avec LC091 et LC100 cultivés sur du xylose. Des métabolites sélectionnés de la phase logarithmique précoce, de la phase logarithmique moyenne et de la phase logarithmique tardive ont été analysés (Fig. 8 supplémentaire) et les scores Z ont été tracés comme Fig. 3a. En général, nous avons observé que LC091 accumulait plus de métabolites à la fois dans la voie EDEMP et dans le cycle TCA, à la fois intracellulaire et extracellulaire, tandis que LC100 démontrait une plus grande accumulation de métabolites liés à la voie shikimate (Fig. 3a). Il y avait trois exceptions importantes de composés liés à la voie du shikimate qui étaient plus abondants dans LC091, à savoir la l-tyrosine, la l-phénylalanine et le l-tryptophane, qui sont tous des acides aminés aromatiques dérivés du chorismate (Fig. 3b – d). Chez Pseudomonas aeruginosa, il a été précédemment rapporté que la l-tyrosine et le l-tryptophane pouvaient fortement inhiber les synthases DAHP natives AroF-1 et AroF-244. Ainsi, nous postulons que AroF-1 et AroF-2 pourraient être moins inhibés dans LC100 par rapport à LC091. Bien qu'une DAHP synthase résistante à la rétroaction aroGD146N ait été surexprimée dans nos souches, des études antérieures ont montré que les DAHP synthases natives AroF-1 et AroF-2 seules entraînaient une production d'environ 30 % de PCA et de phénol par rapport à une surexpression supplémentaire d'aroGD146N, chez P. putida45 et Pseudomonas taiwanensis46, respectivement. Nous avons pensé que l'amélioration de la production de muconate de LC100 par rapport à LC091 pourrait être due à une inhibition plus faible d'AroF-1 et d'AroF-2 (Fig. 3b – e), et la concentration réduite de PEP et l'accumulation accrue de DAHP dans LC100 corroborent cette interprétation ( figure 3a).

une carte thermique des métabolites intracellulaires et extracellulaires sélectionnés. Les scores Z ont été calculés en utilisant les intensités moyennes des métabolites intracellulaires et extracellulaires séparément, et un contrôle au temps zéro du milieu non inoculé a également été inclus pour l'analyse des métabolites extracellulaires. b – e Intensités des métabolites sélectionnés de la phase logarithmique tardive, "In" représente intracellulaire, "Ex" représente extracellulaire et "ND" représente non détecté. Le signal d'intensité intracellulaire a été recueilli à l'aide du culot cellulaire d'une culture cellulaire de 1 mL, et le signal d'intensité extracellulaire a été recueilli à l'aide de 20 μL du surnageant correspondant. f Structure de XylE (PDB ID : 4GBY) 48 avec les résidus des emplacements de mutation dérivés de l'ALE marqués en vert. Le d-xylose est représenté en boule et bâtons noirs. g Courbe de croissance de la souche LC111 comparée à JE3692 sur milieu M9 additionné de xylose 30 mM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

De plus, une autre explication pourrait être que PP_2569 est capable de transporter les acides aminés aromatiques de manière extracellulaire - cependant, nous n'avons pas observé l'accumulation extracellulaire de ces acides aminés (Fig. 3b – d). Au lieu de cela, nous avons trouvé une accumulation extracellulaire substantielle d'acide anthranilique dans LC100 (Fig. 3e). L'acide anthranilique est un précurseur du l-tryptophane et un produit direct du chorismate, qui est un nœud important dans la voie du shikimate à partir de laquelle tous les acides aminés aromatiques sont dérivés. Le chorismate a été signalé comme étant instable au niveau intracellulaire47 et n'a pas été détecté dans nos échantillons de métabolomique intracellulaire. Sur la base des résultats actuels, nous avons émis l'hypothèse que PP_2569 pourrait être capable d'exporter de l'acide anthranilique, ce qui pourrait entraîner une diminution de l'accumulation intracellulaire de l-tryptophane (Fig. 3d, e). L'accumulation accrue d'acide anthranilique peut également réduire le flux du chorismate vers d'autres acides aminés aromatiques, entraînant une accumulation réduite de l-tyrosine et de l-phénylalanine dans la souche LC100. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour étudier la base mécaniste de cette mutation bénéfique dérivée de l'ALE.

Séparément, pour étudier le mécanisme des mutations dans XylE, cinq mutations des isolats 1 à 5 (A62V, A62V et A455V, T34I, L214P, S205F, pour les isolats 1, 2, 3, 4, 5, respectivement) ont été marquées dans le structure (PDB ID : 4GBY)48, soulignant que les mutations étaient toutes situées dans les domaines transmembranaires (Fig. 3f). Auparavant, Jiang et al. ont démontré que l'introduction de deux mutations (G58W et L315W) dans XylE pouvait empêcher la liaison de deux inhibiteurs par des changements conformationnels49. Notamment, le site G58W est dans le même domaine transmembranaire à A62V et proche de T34I dans la structure. Étant donné que la souche LC345 non productrice de muconate avec XylE de type sauvage et un fond génétique similaire à QP328 a bien poussé sur le xylose (Fig. 2a supplémentaire), nous avons émis l'hypothèse que les mutations de XylE survenues dans l'ALE pourraient être induites par un ou plusieurs inhibiteurs. de la souche de fond productrice de muconate. Nous avons également introduit les mutations xylE-A62V et A455V dans la souche JE3692, précédemment rapportées comme se développant sur des hydrolysats lignocellulosiques, générant LC111. Les deux souches ont été évaluées dans un lecteur de plaques sur xylose. LC111 a démontré une croissance améliorée avec un temps de latence réduit et un taux de croissance plus élevé par rapport à JE3692 (Fig. 3g). La légère amélioration peut être causée par les traces d'inhibiteur(s) des voies natives, et cela peut également suggérer que l'introduction de xylE-A62V, A455V peut améliorer l'utilisation du xylose pour la production d'autres produits liés à la voie non shikimate.

La duplication de 227,8 ko a été identifiée sur la base d'une couverture de séquençage environ deux fois plus élevée de PP_5050 à PP_5242 par rapport au reste du génome (Fig. 4a). Cependant, il était difficile d'identifier l'emplacement exact de la région dupliquée sur la base des données de séquençage en raison de la courte longueur de lecture du séquençage Illumina50,51. Nous avons donc supprimé la région d'origine de PP_5050 – PP_5242 dans QP478, en utilisant les séquences connues en dehors de la région comme bras homologues, pour générer LC171, et supprimé une partie de la duplication de PP_5084 – PP_5242 pour générer la souche LC173. Sur du xylose 30 mM dans du milieu M9, LC171 avec la suppression de toute la région présentait un taux de croissance plus faible, tandis que LC173 avec une suppression partielle présentait une croissance comparable avec un retard de croissance légèrement plus long et un taux de croissance accru par rapport à QP478 (Fig. 4b). Sur la base de ces résultats, nous avons conclu que la duplication est importante pour les performances de QP478 et que le ou les gènes bénéfiques potentiels devraient se trouver dans la région PP_5050 – PP_5083, qui reste intacte dans LC173. Ainsi, nous avons ensuite cherché à identifier le ou les gènes dans cette région qui ont contribué à l'amélioration de la croissance sur le xylose.

a Identification de la région dupliquée à partir des données de séquençage de nouvelle génération, qui présentaient ~ 2 × le nombre de lectures de séquençage dans QP478, et des suppressions complètes et partielles de ces régions dupliquées dans LC171 et LC173, respectivement. Les graphiques de couverture ont été générés dans Geneious Prime 2020.0.4. b Courbes de croissance de QP478, LC171 et LC173 sur milieu M9 avec 30 mM de xylose. λ représente le retard de croissance, μA représente le taux de croissance absolu et les deux sont les valeurs moyennes de trois courbes de croissance indépendantes. c Gènes candidats surexprimant dans la souche LC100 rétro-conçue sur le site ΔpykF. d Courbes de croissance de QP478, LC100, LC199 et LC224 sur milieu M9 avec 30 mM de xylose. e Taux de croissance spécifiques maximaux extraits du panel d. f Valeurs de retard de croissance extraites du panel d. g – i Profils dans des expériences en flacon agité de la souche LC224 sur milieu M9 avec du xylose 30 mM, du glucose 30 mM + du xylose 15 mM et du glucose 30 mM, respectivement. Pour les expériences en flacon agité, le % de rendement molaire a été calculé comme [mM muconate/mM (glucose + xylose) × 100], et le % de rendement en carbone a été calculé comme [mM muconate × 6/mM (glucose × 6 + xylose × 5) × 100 ]. Les barres d'erreur représentent ici l'écart type de trois répétitions biologiques. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Étant donné que le glucose et le xylose étaient tous deux utilisés à des taux également faibles dans LC100 (Fig. 2d), nous avons estimé que la croissance lente pourrait se manifester dans une ou plusieurs parties de la voie partagée par les deux sucres. Trois gènes candidats dans PP_5050–PP_5083 ont été sélectionnés pour la surexpression dans LC100, dont un lié au métabolisme des sucres, PP_5056 (gpmI, 2,3-bisphosphoglycérate-independent phosphoglycerate mutase), et deux dans la voie du shikimate, PP_5078 (aroB, 3-dehydroquinate synthase) et PP_5079 (aroK, shikimate kinase) (Fig. 4c). Deux autres gènes extérieurs à cette région mais liés au métabolisme des sucres ont également été testés, notamment PP_5085 (maeB, enzyme malique B) et PP_5150 (rpiA, ribose-5-phosphate isomérase A). Des cassettes de surexpression des cinq gènes ont ensuite été insérées individuellement au site ΔpykF, générant les souches LC147 (gpmI), LC150 (maeB), LC151 (rpiA), LC199 (aroK) et LC224 (aroB). Tous ces gènes étaient pilotés par le promoteur Ptac à l'exception de gpmI, qui était piloté par le promoteur Plac après deux tentatives infructueuses d'insertion du gène dans le génome à l'aide de Ptac. Les souches résultantes ont ensuite été évaluées avec LC100 et QP478 dans un lecteur de plaques contenant du milieu M9 et du xylose 30 mM (Fig. 4d – f). La surexpression des trois gènes liés au métabolisme des sucres dans LC100 n'a pas réduit le retard de croissance, tandis que les souches LC150 et LC151 ont démontré des taux de croissance plus élevés et une plus grande accumulation de biomasse finale (Fig. 9 supplémentaire). Considérant qu'un rendement de biomasse plus élevé peut réduire le rendement de muconate, comme nous l'avons observé avec la souche LC091 (Fig. 2b – d), nous avons décidé de ne pas poursuivre ces objectifs plus avant. Les souches LC199 et LC224, qui surexpriment respectivement aroK et aroB, ont toutes deux démontré des taux de croissance améliorés et un retard de croissance réduit par rapport à LC100 (Fig. 4d – f). LC224 a augmenté encore plus rapidement que QP478 avec un temps de latence similaire et un taux de croissance plus élevé (Fig. 4d – f).

Pour étudier l'effet additif potentiel de la surexpression de aroK et aroB, nous avons également exprimé aroK et aroB dans un modèle de type opéron comme aroKB dans LC100, générant la souche LC168. Les souches LC199, LC224, LC168 et QP478 ont été évaluées dans des expériences en flacon agité avec du milieu M9 contenant du glucose et du xylose pour examiner la production de muconate. La souche de surexpression aroB LC224 a surpassé son homologue évolué QP478 avec un rendement en muconate plus élevé et un taux de croissance amélioré (Fig. 10a, c supplémentaires), ce qui suggère que la réaction du DAHP au 3-déshydroquinate (3DHQ) limitait la vitesse dans LC100. La surexpression de aroK dans LC100 (générant LC199) a légèrement augmenté le taux de croissance (Fig. 10b, d supplémentaires). La souche LC168 n'a pas présenté d'amélioration par rapport à LC224 (Fig. 10c, e supplémentaires).

Pour déterminer si la surexpression d'aroB seule peut conduire à de meilleures performances de souche, nous avons surexprimé aroB dans QP328, générant la souche LC349. Dans l'évaluation du lecteur de plaques des souches LC349, QP328 et LC224, LC349 a présenté le taux de croissance le plus élevé sur le glucose et un taux de croissance légèrement inférieur sur le mélange de glucose et de xylose par rapport à LC224, alors que, sans surprise, une croissance beaucoup plus lente sur le xylose par rapport à LC224 (Fig. 11a–c), probablement en raison de l'absence de mutations dans xylE. Fait intéressant, dans une expérience de flacons agités sur un mélange de glucose et de xylose, LC349 a surpassé QP328 avec un rendement en muconate beaucoup plus élevé, qui était toujours nettement inférieur à LC224 (Fig. 11d – f supplémentaires). La production de muconate de LC349 est plus lente que celle de LC224, car il a fallu jusqu'à 41 h pour LC349 et 26,5 h pour LC224 pour atteindre le titre maximal de muconate (Fig. 11e, f supplémentaires).

Nous avons ensuite examiné les performances de LC224 sur un milieu M9 contenant du glucose, du xylose ou un mélange des deux. Les rendements en muconate étaient les plus élevés sur le xylose, les plus faibles sur le glucose et intermédiaires sur le mélange (Fig. 4g – i), reflétant l'avantage d'introduire du xylose dans la voie des pentoses phosphates pour fournir l'E4P. Fait intéressant, les taux d'utilisation du glucose et du xylose étaient plus élevés avec le mélange de glucose et de xylose par rapport au glucose ou au xylose seul (Fig. 4g – i).

Des cultures en bioréacteur de LC224 et QP478 ont été menées en mode discontinu pour maintenir des concentrations de sucre (glucose et xylose) inférieures à 10 g L-1 (Fig. 12a – c supplémentaires). Le glucose et le xylose ont été utilisés simultanément dans les deux souches dès le début de la culture (Fig. 5a, b) ; cependant, les taux d'utilisation du sucre étaient plus élevés dans LC224 que QP478. LC224 a utilisé 46 g L-1 de glucose et 20 g L-1 de xylose à la fin de la culture tandis que QP478 a utilisé 34 g L-1 et 10 g L-1, respectivement. Le titre de muconate était presque trois fois plus élevé dans LC224 par rapport à QP478, a 26,8 g L-1 et 9,3 g L-1, respectivement (Fig. 5a, b). Les rendements en muconate ont atteint 50% (rendement molaire) dans LC224 tandis que les rendements étaient de 25, 9% dans QP478 (Fig. 5a, b). Ces améliorations de LC224 se sont également reflétées dans le taux de production global de muconate (0,28 g L-1 h-1), qui était nettement supérieur à celui obtenu dans QP478 (0,10 g L-1 h-1) (Fig. 5a, b) .

a, b Croissance bactérienne, utilisation du glucose et du xylose et titres, rendements et taux de muconate de QP478 et LC224 dans des cultures de 96,6 h. c Croissance bactérienne, utilisation du glucose et du xylose et titre, rendements et taux de muconate à partir de LC224 en culture de 191 h. Pour a et b, les points de données représentent les valeurs moyennes des doublons biologiques, les barres d'erreur représentent la différence absolue entre les données générées à partir des doublons à chaque instant ; pour (c), les points de données représentent les valeurs des singulets. Les rendements métaboliques (% en moles) à chaque instant ont été calculés comme la quantité de muconate (en moles) produite divisée par le glucose et le xylose (en moles) utilisés. Les rendements métaboliques (mol %) sont corrigés en fonction du facteur de dilution généré par les volumes d'alimentation de base et de substrat. Les rendements finaux en carbone (% de carbone) répertoriés ont été calculés comme [mM muconate × 6/mM (glucose × 6 + xylose × 5) × 100]. Les taux (g L-1 h-1) à chaque instant ont été calculés comme la concentration de muconate divisée par le temps de culture. Toutes les valeurs de titre (T), de débit (R) et de rendement (Y) répertoriées étaient au dernier point dans le temps. Les rendements finaux (mol%, carbone%) énumérés en (c) ont également été corrigés en fonction du volume évaporé quantifié. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Le titre, le taux et le rendement de muconate obtenus dans les cultures en bioréacteur étaient de 26, 8 g L-1, 0, 28 g L-1 h-1 et 49, 9% (Fig. 5b), respectivement, à 96, 6 h. Ce rendement représente presque 100 % du maximum théorique basé sur notre conception de souche et notre modélisation métabolique (vida supra). Pour explorer si le titre pouvait être encore amélioré, nous avons mené une autre expérience de bioréacteur où LC224 a été cultivé pendant 191 h (Fig. 5c). Le titre de muconate résultant a augmenté à 33,7 g L-1 et à un rendement de 46%, 92% du maximum théorique une fois corrigé pour l'évaporation. Il convient également de noter que, bien que LC224 ait atteint la phase stationnaire à environ 54 h, les cellules ont continué à utiliser des sucres et à produire du muconate, ce qui a démontré que la production de muconate ici n'était pas couplée à la croissance, ce qui suggère que le titre et le rendement en muconate pourraient être encore améliorés si l'expérience avait continué (Fig. 5b, c).

Pour mieux comprendre les différences entre le parent non évolué QP328, la souche évoluée QP478 et la souche LC224 conçue de manière rationnelle, des expériences de métabolomique intracellulaire et extracellulaire ont été menées. Des métabolites sélectionnés liés au métabolisme du sucre et à la production de muconate sont présentés à la Fig. 6. Par rapport à QP328, les souches QP478 et LC224 présentaient une accumulation réduite de métabolites dans le cycle EDEMP et une plus grande accumulation de métabolites dans les voies du shikimate et du muconate (Fig. 6a, b), ce qui est cohérent avec les mutations qui ont évolué dans QP478 et ont été modifiées dans LC224 (Figs. 2 et 4). Les intensités de DAHP, le nœud commun du métabolisme du sucre et de la voie du shikimate, ont cependant démontré le schéma opposé par rapport aux autres métabolites de la voie du shikimate (Fig. 6b). LC224 et QP478 ont accumulé moins de DAHP par rapport à QP328, ce qui est cohérent avec notre objectif ci-dessus concernant la duplication et la surexpression d'aroB.

a Voie métabolique simplifiée. Les métabolites du cycle EDEMP sont étiquetés en bleu, dans la voie du shikimate et du muconate sont étiquetés en vert, le nœud articulaire DAHP est étiqueté en violet, l'acide anthranilique extracellulaire (ANA) est étiqueté en marron. QA acide quinique, ANA acide anthranilique. b Intensité des métabolites sélectionnés dans les trois souches QP328 (bleu), QP478 (orange) et LC224 (rouge). Les intensités intracellulaires ont été normalisées par la biomasse lyophilisée. Les barres d'erreur représentent l'écart type de trois répétitions biologiques. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Plus précisément, le niveau de DAHP dans LC224 était bien inférieur à celui de QP478, ce qui peut suggérer que l'activité aroB dans LC224 entraînée par le promoteur tac était supérieure à celle de QP478. À l'exception du DAHP, LC224 a accumulé une plus grande quantité de métabolites dans la voie du shikimate et moins de métabolites dans le cycle EDEMP par rapport à QP478 (Fig. 6a, b), suggérant un flux plus important entrant dans la voie du shikimate dans LC224 et permettant une plus grande biosynthèse du muconate.

Bien que son précurseur 3DHQ n'ait été détecté dans aucun échantillon, l'acide quinique (quinate, QA) s'est substantiellement accumulé dans LC224 (Fig. 6b), ce qui peut suggérer un débordement de carbone résultant d'une surexpression d'aroB. L'accumulation d'acide shikimique (shikimate, SA) dans LC224 est la preuve de la biosynthèse du muconate par la voie aroE, tandis que l'accumulation de SA était beaucoup plus faible dans QP478 par rapport à LC224, ce qui peut être lié à la duplication d'aroK dans QP478. L'accumulation d'acide anthranilique dans les milieux de culture représente probablement un autre cas de métabolisme de débordement. Plus de catéchol (CAT) s'est accumulé dans LC224 (Fig. 6b), ce qui pourrait représenter de nouveaux goulots d'étranglement associés à un flux accru vers le muconate. Ensemble, ces résultats illustrent que l'ingénierie pour générer LC224 a largement récapitulé la souche évoluée QP478 et suggère des cibles supplémentaires pour une amélioration supplémentaire.

Des technologies pour la production de produits chimiques biosourcés durables sont nécessaires pour remplacer les produits pétrochimiques en place. L'ingénierie de souches pour convertir les sucres lignocellulosiques tels que le glucose et le xylose en produit à un titre, un taux et un rendement pertinents sur le plan industriel est essentielle à cette entreprise. Dans ce travail, le rendement molaire théorique maximal de muconate à partir d'un mélange de glucose et de xylose est passé d'environ 40 % avec du glucose seul à 50 % lorsque la teneur en xylose dans le mélange est comprise entre 33 et 40 % (mol%), ce qui est un rapport pertinent dans les hydrolysats lignocellulosiques (Fig. 1b, Fig. 1 supplémentaire). Ceci a été réalisé en introduisant la voie de la d-xylose isomérase pour fournir l'E4P et en réintroduisant pgi-1 pour activer le cycle EDEMP. L'ALE a été utilisée pour identifier des cibles supplémentaires pour concevoir une souche qui a finalement atteint un rendement de 46 % sur un mélange de glucose et de xylose (Fig. 5c), considérablement plus élevé que les 35,6 % que nous avions obtenus précédemment avec une souche conçue pour convertir le glucose seul32.

Au cours de l'ALE, des mutations de xylE sont apparues dans tous les isolats sélectionnés (Fig. 2a et 3f) qui ont amélioré la croissance sur le xylose. Les cinq mutations se trouvent dans les domaines transmembranaires du transporteur (Fig. 3f). Sur la base de travaux antérieurs dans le même système35 et de nos propres données montrant que le métabolisme du xylose était inhibé dans la souche productrice de muconate QP328 (Fig. 1c et 2b) mais pas dans l'analogue non producteur de muconate LC345 (Fig. 2a supplémentaire), nous proposons que les mutations étaient une réponse aux inhibiteurs de la souche de fond productrice de muconate. D'autres recherches pour identifier et caractériser les inhibiteurs potentiels seront poursuivies dans des travaux futurs. De plus, l'expression accrue de PP_2569, un transporteur MFS putatif, activée par une mutation ponctuelle G → A dans la région promotrice, a conduit à un rendement en muconate sensiblement plus élevé et à un rendement en biomasse plus faible dans LC100 (Fig. 2b, c), et l'analyse métabolomique a suggéré un le flux métabolique redirige du cycle EDEMP vers la voie du shikimate (Fig. 3a). L'analyse métabolomique intracellulaire et extracellulaire des souches LC091 et LC100 cultivées sur du xylose a suggéré que PP_2569 pourrait être capable d'exporter de l'acide anthranilique, réduisant ainsi l'accumulation intracellulaire d'acides aminés aromatiques, connus pour inhiber les DAHP synthases natives. Nous avons également observé des intensités plus élevées d'acide anthranilique extracellulaire dans les souches QP478 et LC224 par rapport à la souche non évoluée QP328 (Fig. 6b). Les études mécanistes avec PP_2569 peuvent être utiles pour une ingénierie plus poussée.

L'ALE a également entraîné une duplication de la région génomique de PP_5050 à PP_5242. Dans cette région, nous avons démontré que la surexpression d'aroB était nécessaire pour atteindre des taux de croissance élevés sur le xylose dans LC224. Dans la souche GB062, une souche précédemment conçue pour améliorer la conversion du glucose en muconate en supprimant hexR dans CJ5223, la transcriptomique a indiqué que l'expression d'aroB était déjà augmentée lors de la suppression de hexR32. Dans une autre étude dans laquelle P. putida a été conçu pour produire du PCA à partir de glucose, la surexpression d'aroB n'a pas contribué à l'amélioration de la production45. Cependant, dans la souche LC100 cultivée sur un mélange de glucose et de xylose, l'activité d'AroB semblait limiter la vitesse, car la surexpression d'aroB dans LC224 améliorait la croissance et la production de muconate (Fig. 4d – i et Supplémentaire Fig. 10b, c). Cela peut indiquer qu'avec l'entrée du xylose dans la voie non oxydante des pentoses, l'apport d'E4P a été amélioré, entraînant une augmentation du flux de carbone dans la voie du shikimate via la condensation d'E4P et de PEP en DAHP. Le niveau amélioré de DAHP a rendu la réaction suivante, catalysée par AroB, limitant la vitesse, là où elle ne l'était pas auparavant. Dans l'ensemble, la stratégie d'ingénierie présentée ici pour améliorer le flux de carbone dans et à travers la voie du shikimate pourrait être mise à profit pour améliorer la production d'autres produits dérivés du shikimate à partir de glucose et de xylose chez P. putida.

Notre souche LC224 conçue de manière rationnelle a surpassé la souche évoluée QP478 en croissance sur xylose (Fig. 4d). Une raison potentielle pourrait être la redondance, la complexité et le fardeau de la grande duplication dans QP478. De telles duplications sont probablement activées par la recombinaison au sein de séquences similaires à deux endroits ou plus du génome, de sorte que la duplication de certaines régions est favorisée ou limitée, limitant finalement la capacité de l'évolution à obtenir des résultats idéaux dans des délais de laboratoire. L'ingénierie du génome, cependant, peut être utilisée pour apporter des modifications précises. En effet, la surexpression d'aroB seul dans LC224 a surpassé QP478 (Fig. 4d – f et Supplémentaire Fig. 10a, c), qui contient la totalité de la duplication PP_5050 – PP_5242. Cela démontre l'utilité et la puissance de l'ALE en tant qu'outil pour identifier les cibles d'une ingénierie rationnelle.

La surexpression d'aroB a considérablement amélioré l'utilisation du sucre de LC224 par rapport à LC100 (Figs. 2d et 4h). Dans l'analyse métabolomique, le niveau intracellulaire de DAHP de LC224 est inférieur à celui des deux autres souches (Fig. 6). Cela peut suggérer que l'accumulation de DAHP a un effet négatif sur le métabolisme des sucres qui peut être atténué par la surexpression d'aroB. De plus, la surexpression d'aroB seule dans QP328, générant LC349, a entraîné un rendement en muconate légèrement inférieur à celui de LC224 sur un mélange de glucose et de xylose (Fig. 11d – f supplémentaires). Étant donné que la restauration de la mutation G → A dans PPP_2569 dans la souche QP478 n'a pas eu d'effet comparable à l'ingénierie inverse dans LC091 en termes de variation du rendement en muconate (Fig. 2c et Fig. 6g, h supplémentaires), ces résultats peuvent suggérer que aroB la surexpression (résultant de la duplication) et la régulation à la hausse de PP_2569 ont un effet similaire sur la réduction de la rétro-inhibition des DAHP synthases, ce qui a conduit à un flux amélioré dans la voie de biosynthèse du muconate.

L'analyse métabolomique de nos souches modifiées fournit un aperçu précoce des futurs efforts d'ingénierie pour améliorer encore la production de muconate, au-delà de ce que nous avons démontré ici avec LC224, qui sera poursuivi dans de futures études. L'accumulation de quinate par cette souche (Fig. 6b) peut suggérer une approche pour améliorer ses performances en surexprimant aroQ ou en supprimant quiA. En ce qui concerne l'accumulation de shikimate, la surexpression d'aroB et d'aroK n'a pas amélioré les performances de LC168 par rapport à LC224, la souche équivalente surexprimant aroB seul (Fig. 4h et Supplémentaires Fig. 10c, e). Cela peut suggérer des goulots d'étranglement potentiels dans les étapes en aval de la voie, en particulier compte tenu du niveau relativement élevé d'acide anthranilique extracellulaire (ANA) accumulé par QP478 (Fig. 6b). Une conversion insuffisante du chorismate (CSA) en 4-hydroxybenzoate (4HB) pourrait être une cause d'accumulation d'acide anthranilique. Le gène ubiC-C22 codant pour la chorismate pyruvate-lyase, qui était auparavant conçu pour réduire l'inhibition du produit, était piloté dans nos souches par le promoteur lac relativement faible, et une approche potentielle pour accélérer la biosynthèse du muconate via le shikimate dans LC224 pourrait être de surexprimer aroK tout en augmentant simultanément le niveau d'expression d'ubiC-C22.

Une analyse technico-économique menée précédemment pour la conversion du glucose ainsi que des sucres de glucose et de pentose3 a indiqué que le prix de vente minimum (MSP) du muconate diminuerait considérablement avec un rendement et un taux accrus. Notre souche GB271 modifiée a produit du muconate à partir de glucose avec un rendement de 36 % et un taux de 0,21 g L−1 h−1, ce qui correspond à un MSP d'environ 3 $ kg−1 selon ce modèle32. Ici, LC224 a atteint un rendement de près de 50 % à 0,28 g L-1 h-1 (Fig. 5b). Cela réduirait le MSP à environ 2,2 $ kg−1, ce qui est proche du MSP de 1,96 $ précédemment prédit comme étant commercialement viable3. Le modèle suggère que le MSP peut être encore réduit en augmentant le taux et le rendement. Considérant que le rendement molaire de 50 % est déjà au maximum théorique dans notre conception de souche, de nouvelles augmentations de taux seront essentielles pour les améliorations MSP.

En conclusion, ce travail démontre une stratégie efficace pour produire du muconate à partir de glucose et de xylose à l'aide de P. putida. Compte tenu du rendement et du titre prometteurs de muconate à partir de glucose et de xylose, notre souche LC224 pourrait également représenter une souche plate-forme prometteuse pour la production d'autres composés dérivés de la voie shikimate.

Q5® High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs) a été utilisé pour toutes les réactions en chaîne par polymérase, suivi d'une digestion DpnI (New England Biolabs) pour éliminer la matrice plasmidique dérivée des cellules si nécessaire. NEBuilder HiFi Assembly Master Mix (New England Biolabs) a été utilisé pour la construction de plasmides, suivi d'une transformation en E. coli NEB 5-α F'Iq chimiquement compétent (New England Biolabs), ou en E. coli électrocompétent CopyCutter™ EPI400™ pour augmenter rendement plasmidique, le tout selon les instructions du fabricant. Les transformants ont été sélectionnés sur des plaques de gélose Lysogeny Broth (LB) (Lennox) additionnées de 50 μg mL-1 de kanamycine (Sigma-Aldrich) et cultivés pendant une nuit à 37 °C. Les constructions correctes ont été confirmées par séquençage Sanger (GENEWIZ, Inc.). Certains plasmides ont été synthétisés (Twist Bioscience). Des informations détaillées sur la construction de plasmides sont décrites dans les données supplémentaires 2. Les séquences des plasmides synthétisés se trouvent dans les données supplémentaires 3. Les oligos utilisés dans la construction de plasmides sont répertoriés dans les données supplémentaires 4.

Des délétions, des insertions et des remplacements de gènes ont été effectués en utilisant le gène nptII résistant à la kanamycine comme marqueur de sélection pour la recombinaison homologue de premier tour du plasmide dans le chromosome et le gène sacB sensible au saccharose comme marqueur de contre-sélection pour le second tour de recombinaison homologue. recombinaison hors du chromosome52. Les délétions, les insertions et les remplacements de gènes corrects ont été identifiés par le produit PCR de diagnostic de colonie en fonction des différences de taille ou de présence du produit à l'aide du MyTaqTM Red Mix (Bioline). Pour les insertions et les restaurations de mutations ponctuelles, les remplacements corrects ont été criblés en comparant l'intensité des bandes des produits de PCR de la colonie à l'aide d'amorces dont le nucléotide 3' s'annelé au nucléotide muté, suivi d'une confirmation par séquençage Sanger.

Les plasmides ont été transformés en P. putida par électroporation ou conjugaison. Pour l'électroporation, des souches de P. putida ont été inoculées à partir d'un stock de glycérol dans du milieu LB et cultivées pendant une nuit à 30 ° C, 225 tr/min. Les cellules électrocompétentes ont été préparées en centrifugant 2,5 ml de culture pendant la nuit et en lavant trois fois dans du saccharose 300 mM, puis en remettant les cellules en suspension dans 50 μL de saccharose 300 mM53. Les plasmides pour l'électroporation ont été construits en utilisant le plasmide squelette pK18sB54 et électroporés dans une cuvette de 0, 1 cm en utilisant un Gene Pulser Xcell (Bio-Rad) avec le réglage 1, 6 kV, 25 μF, 200 ohms. L'ensemble du processus a été réalisé à température ambiante. Pour la conjugaison, des plasmides ont été construits sur la base du plasmide squelette pK18msB qui contient le R4P oriT, et ont été transférés des cellules du donneur E. coli S17-155 aux souches réceptrices de P. putida. La souche donneuse E. coli S17-1 contenant le plasmide a été inoculée dans du milieu LB additionné de 50 μg mL-1 de kanamycine et cultivée dans un incubateur à agitation à 37 ° C, 225 tr / min pendant la nuit; la souche réceptrice de P. putida a été inoculée dans du milieu LB et cultivée dans un incubateur à agitation pendant une nuit à 30 ° C, 225 tr/min. Par la suite, 1 ml de cellules donneuses et receveuses pendant la nuit ont été centrifugées à 5000 × g pendant 2 min et lavées deux fois avec du milieu LB, puis les culots ont été remis en suspension et 400 µl de chacun ont été mélangés dans un tube de microcentrifugeuse et centrifugés à nouveau. Les culots mélangés ont été remis en suspension à l'aide de 50 µL de milieu LB et déposés sur une plaque LB avec deux antibiotiques à faible concentration : 10 μg mL-1 de chloramphénicol pour inhiber la croissance cellulaire d'E. coli S17-1 et 5 μg mL-1 de kanamycine pour inhiber croissance cellulaire de P. putida. La plaque a été incubée à 30 ° C pendant 6 à 10 h pour permettre la conjugaison, après quoi les cellules ont été striées pour des colonies uniques sur la même plaque et incubées à 30 ° C pendant la nuit. Des colonies uniques sur la plaque LB contenant des antibiotiques à faible concentration ont été repiquées sur une nouvelle plaque LB avec 100 μg mL-1 de chloramphénicol, auquel P. putida est naturellement résistant, et 50 μg mL-1 de kanamycine, pour sélectionner les transconjugants. Toutes les souches utilisées dans cette étude sont décrites dans le tableau 1, des informations détaillées sur la construction des souches sont décrites dans les données supplémentaires 5.

For shake flask and growth curve experiments, seed cultures were inoculated from glycerol stocks into 14-mL round bottom Falcon® tubes containing 5 mL of LB Miller medium and incubated overnight at 30 °C and 225 rpm. Overnight cultures were then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 10 mL LB medium to an initial OD600 of 0.2. These second seed cultures were cultivated at 30 °C at 225 rpm for 4 h to reach an OD600 of ~2. The second seed cultures were washed twice with M9 salts (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl) and then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 25 mL modified M9 minimal medium (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl, 2 mM MgSO4, 100 µM CaCl2, 18 µM FeSO4) supplemented with either 30 mM xylose, 30 mM glucose, or mixture of 30 mM glucose and 15 mM xylose, to an initial OD600 of 0.1. The molar ratio of glucose and xylose in mixed substrates is 2:1, which is the ratio typical of corn stover hydrolysates10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3149"> 56. Toutes les courbes de croissance ont été caractérisées sur des analyseurs Bioscreen C Pro (Growth Curves US) en utilisant des cultures de 300 µL inoculées comme décrit pour les flacons agités ci-dessus. Les données des flacons agités et des lecteurs de plaques ont été tracées et analysées à l'aide de GraphPad Prism version 8.4.2. Le taux de croissance absolu (μA) et le retard de croissance (λ) ont été calculés sur la base de l'équation de Gompertz en utilisant les paramètres par défaut de l'outil FittR déposé dans GitHub (https://github.com/scott-saunders/growth_curve_fitting)57. Dans certains cas, la phase de mort a été retirée de la courbe de croissance pour s'adapter au modèle.

Les valeurs de pH des flacons ont été contrôlées à chaque point de temps d'échantillonnage à l'aide d'un mini pH-mètre (HORIBA LAQUAtwin pH-33) et, si nécessaire, du NaOH 1 N a été utilisé pour ajuster le pH à 7. Pour les expériences en flacon agité, les rendements ont été calculés. au moment où la concentration maximale de muconate a été détectée.

Un modèle métabolique cœur-carbone de P. putida3, qui considère la réaction illustrée à la Fig. 1a, a été étendu avec des réactions de la voie de synthèse aroE, en utilisant la stoechiométrie adaptée à partir d'un modèle à l'échelle du génome de P. putida KT244058. Les calculs de rendement ont été effectués en supposant qu'il n'y a pas d'exigence de maintenance en ATP en optimisant le flux de muconate tout en faisant varier la fraction de xylose dans le milieu. Les calculs ont été effectués à l'aide de la bibliothèque cobrapy (version 0.22.1) dans Python 3.8.1059.

Pour effectuer l'ALE, la souche QP328 a d'abord été inoculée dans un milieu LB Miller à partir d'un stock de glycérol et cultivée pendant la nuit sous forme de culture d'ensemencement. Les cellules de la culture d'une nuit ont ensuite été lavées deux fois avec des sels M9 et remises en suspension dans des sels M9. Les cellules lavées ont été inoculées à une DO6oo initiale de 0,1 dans un tube de culture contenant 5 ml de milieu M9 avec 10 mM de xylose comme seule source de carbone et cultivées à 30 ° C avec agitation à 225 tr/min. Des passages en série ont été effectués en transférant 1 % (v/v) de la culture dans du milieu frais lorsque la croissance a été observée, ce qui a initialement pris jusqu'à environ deux semaines de culture. Le nombre de générations a été calculé sur la base de la valeur OD600, selon l'Eq. (1):32

Les populations initiales, intermédiaires périodiques et finales ont été conservées sous forme de stocks de glycérol.

Les isomères d'acide cis, cis et cis, trans-muconique ont été analysés en préparant un standard unique d'acide cis, trans-muconique pour accomplir une quantification précise des deux isomères d'acide muconique60. La séparation et la détection ont été réalisées en utilisant les conditions chromatographiques suivantes. Les échantillons et les standards ont été analysés à l'aide d'un UHPLC Agilent série 1290 (Agilent Technologies) couplé à un détecteur à barrette de diodes (DAD) et une colonne Phenomenex Luna C18(2)-HST 2,5 μm, 2 × 100 mm. Un volume d'injection de 1 μL a été injecté sur la colonne dans laquelle la température a été maintenue constante à 45°C. Les isomères d'acide muconique ont été contrôlés et quantifiés à la longueur d'onde de 265 nm avec une plage de quantification de 1 ppm à 500 ppm. Un gradient de 0,16 % d'acide formique dans de l'eau (A) et de l'acétonitrile (B) a été utilisé à un débit de 0,5 mL min-1. La séparation chromatographique des analytes a été obtenue en utilisant le programme de gradient suivant : initial (t0) à t = 1 min : A-100 % et B-0 % ; rampe vers A-50 % et B-50 % de t = 1 à 7,67 min ; rampe à A-30 % et B-70 % de t = 7,67 à 9,33 min et maintenue jusqu'à 10,67 min. À 10,68 min, le gradient a été ramené à A-100 % et B-0 % et maintenu isocratique pendant une durée totale de 13 min. Une norme de vérification de l'étalonnage a été exécutée tous les 10 à 15 échantillons pour assurer la stabilité du détecteur. Le glucose a été quantifié par HPLC avec détection d'indice de réfraction couplée à une colonne Aminex HPX-87H (Bio-Rad)61, tandis que le xylose a été quantifié de manière similaire et simultanée. Les étalons purs ont été achetés chez Sigma-Aldrich.

Pour la PCR quantitative de transcription inverse (RT-qPCR) de PP_2569 dans les souches LC091 et LC100, les cellules ont été cultivées dans des flacons agités avec du M9 et du xylose 30 mM selon le protocole de flacons agités mentionné ci-dessus. Pour la RT-qPCR de PP_4302 dans les souches LC100 et LC224, les cellules ont été cultivées dans des flacons agités avec du milieu LB. Les cellules ont été récoltées en phase mi-logarithmique et ont été brisées à l'aide du réactif TRI® (Sigma, T9424), suivi d'une miniprep d'ARN à l'aide du kit de miniprep d'ARN Direct-zolTM (Zymo Research, R2052) en suivant le protocole. Les ARN totaux extraits ont ensuite été digérés à l'aide de DNase I (Zymo Research, E1009-A) et purifiés à l'aide du kit RNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research, R1014). Les concentrations d'ARN ont été déterminées à l'aide de NanoDropTM one (Thermo Scientific) à 260 nm, 500 ng d'ARN total de chaque échantillon ont été ajoutés pour la transcription inverse, en utilisant le Supermix de transcription inverse iScript™ (Bio-Rad), pour synthétiser l'ADNc. La RT-qPCR a été réalisée à l'aide du KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich), avec le système de PCR en temps réel rapide 7500 (Applied Biosystems).

Le gène de ménage rpoD a été utilisé comme contrôle de référence pour normaliser différents échantillons62. Les amorces oLC-0109 et oLC-0110 ont été utilisées pour amplifier rpoD ; oLC-0107 et oLC-0108 ont été utilisés pour amplifier PP_2569 ; oLC-0353 et oLC-0354 ont été utilisés pour amplifier PP_4302. Nous avons utilisé la méthode 2-ΔΔCt pour quantifier les niveaux transcriptionnels entre les échantillons63.

Pour évaluer les souches QP478 et LC224 dans des bioréacteurs, les souches ont été inoculées à partir de stocks de glycérol dans des flacons à chicanes de 250 ml contenant 50 ml de LB (Miller) et incubées à 30 ° C et 225 tr/min pendant 16 h. Les cultures de semences ont été menées en double pour chaque souche et chaque réplique a été utilisée pour inoculer des bioréacteurs indépendants. Les cellules ont été centrifugées (5000 xg, 10 min), le surnageant a été jeté et les cellules remises en suspension dans 5 ml de M9 modifié. Le M9 modifié contenait 13,56 g L-1 Na2HPO4, 6 g L-1 KH2PO4, 1 g L-1 NaCl, 2 g L-1 (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 100 μM CaCl2 et 36 μM FeSO4.

Cells were inoculated in 0.5 L bioreactors (BioStat-Q Plus, Sartorius Stedim Biotech) at an initial OD600 of 0.2. The batch phase consisted of growth on 300 mL of modified M9 with 10.6 g L−1 glucose and 4.4 g L−1 xylose, which mimics the sugar ratio in sugar hydrolysates from corn stover10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3452"> 56. La phase fed-batch a été lancée lorsque la concentration en sucre était d'environ 7 g L-1, moment auquel les sucres ont été alimentés pour maintenir les concentrations en sucre entre ~ 2 et 10 g L-1 en modifiant manuellement les taux d'alimentation. La solution d'alimentation contenait 353 g L-1 de glucose et 147 g L-1 de xylose, et son pH a été ajusté à pH 7 avec NaOH. Les bioréacteurs ont été contrôlés à pH 7 par addition de NH4OH 4 N, à 30 °C, et de l'air a été aspergé à 1 vvm. La vitesse d'agitation initiale dans la phase discontinue était de 350 tr/min. Lorsque l'oxygène dissous (OD) atteignait une valeur de 30 %, il était automatiquement contrôlé à ce niveau par des réglages d'agitation automatiques. Des échantillons ont été prélevés périodiquement pour évaluer la croissance bactérienne et pour analyser les concentrations de sucre et de muconate.

Les culots cellulaires et les échantillons de surnageant ont été collectés séparément par centrifugation de 1 ml de cultures en flacon agité cultivées sur un mélange de glucose et de xylose à la phase mi-logarithmique (OD600 ~ 1,0), et les échantillons ont été congelés à -80 ° C jusqu'à l'analyse. . Les culots cellulaires ont été lyophilisés et les métabolites intracellulaires ont été extraits de 3 mg de biomasse séchée à l'aide d'un mélange solvant de chloroforme/méthanol/eau64, et les couches aqueuses et organiques ont été transférées dans un nouveau flacon et complètement séchées. Les métabolites extracellulaires ont été préparés en séchant les échantillons de surnageant sous vide avant l'analyse. Les métabolites ont été chimiquement dérivés selon la méthode ci-dessous65. Afin de protéger les groupes carbonyle et de diminuer la formation d'isomères tautomères, une solution de méthoxyamine (20 µL d'un stock de 30 mg mL-1 dans de la pyridine) a été ajoutée à chaque extrait séché. Les échantillons ont ensuite été incubés à 37°C sous agitation pendant 90 min. Pour éliminer les protons acides dans les groupes hydroxyle, amino et carboxyle, une réaction de triméthylsylilation a été utilisée, en particulier du N-méthyl-N-(triméthylsilyl) trifluoroacétamide avec 1 % de triméthylchlorosilane (80 µL) a été ajouté à chaque flacon. Les échantillons ont été à nouveau incubés à 37°C sous agitation continue pendant 30 min. Une fois l'incubation terminée, les flacons ont été centrifugés et le liquide transféré dans un insert en verre de petit volume. Les échantillons ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse-spectromètre de masse (GC-MS) à l'aide d'une colonne HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm ; Agilent Technologies) pour des analyses non ciblées. Un volume de 1 µL a été injecté de chaque échantillon en mode sans division, et le débit d'hélium gazeux a été établi en utilisant la fonction de verrouillage du temps de rétention basée sur le temps d'élution de l'acide myristique deutéré (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). La température de l'orifice d'injection a été maintenue à 250°C tout au long de l'analyse. Le gradient du four GC a commencé avec une température de 60 ° C maintenue pendant 1 min après l'injection, suivie d'une augmentation à 325 ° C à une vitesse de 10 ° C min-1, se terminant par un maintien de 10 min à 325 ° C. La collecte de données MS couvrait la gamme de masse de 50 à 600 m/z. Un mélange d'esters méthyliques d'acides gras (FAME, C8-C28) a été analysé avec chaque lot d'échantillons pour pouvoir effectuer un alignement de l'indice de rétention dans l'analyse ultérieure des données. Les fichiers de données GC-MS ont été convertis au format CDF, et ils ont été déconvolués et alignés à l'aide du logiciel Metabolite Detector 2.566. L'identification des métabolites a été réalisée par appariement avec les bases de données métabolomiques du PNNL – version augmentée de la base de données Fiehn67. Cette base de données contient des informations sur les spectres de masse et l'indice de rétention de plus de 1000 normes chimiques authentiques et a été recoupée avec des bases de données GC-MS commerciales telles que la bibliothèque spectrale NIST20 et les bases de données GC-MS Wiley 11e version68,69. Trois ions fragments uniques ont été sélectionnés et utilisés pour intégrer les valeurs de surface de pic, et quelques métabolites ont été sélectionnés manuellement si nécessaire.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de séquençage du génome entier qui appuient les résultats de cette étude ont été déposées dans la base de données NCBI SRA avec le numéro d'accession PRJNA783062. PP_2569 est accessible dans la base de données Uniprot en utilisant le lien https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q88JS8/entry. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce travail a été rédigé en partie par Alliance for Sustainable Energy, LLC, le gestionnaire et exploitant du National Renewable Energy Laboratory pour le Département américain de l'énergie (DOE) sous le contrat n° DE-AC36-08GO28308. Ce travail a également été partiellement rédigé par Oak Ridge National Laboratory, qui est géré par UT-Battelle, LLC, pour le DOE américain sous le contrat DE-AC05-00OR22725. Une partie de cette recherche a été effectuée au Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) à l'aide de l'EMSL (grid.436923.9), une installation utilisateur du Bureau des sciences du DOE parrainée par le Bureau de la recherche biologique et environnementale. Le PNNL est un laboratoire national multiprogramme exploité par Battelle pour le Département de l'énergie (DOE) dans le cadre du contrat DE-AC05-76RLO 1830. Le financement a été fourni par le Bureau américain de l'efficacité énergétique et des énergies renouvelables Bioenergy Technologies Office (BETO) pour le Agile BioFoundry. Nous remercions Stefan Haugen, William Michener, Morgan Ingraham et Kelley Hestmark pour leurs efforts d'analyse. Nous remercions Scott Saunders du centre médical du sud-ouest de l'Université du Texas pour l'outil d'ajustement de la courbe de croissance FittR. Nous remercions Eugene Kuatsjah pour son aide avec Pymol. Nous remercions Taraka Dale du Laboratoire national de Los Alamos pour une lecture critique du manuscrit. Nous remercions Jay Fitzgerald et Gayle Bentley du DOE, le professeur Eiji Masai de l'Université de technologie de Nagaoka, Kevin McNaught et les membres de l'Agile BioFoundry pour des discussions utiles.

Centre des ressources renouvelables et des sciences habilitantes, Laboratoire national des énergies renouvelables, Golden, CO, 80401, États-Unis

Chen Ling, Davinia Salvachúa, Colin M. Kneucker, Christopher H. Calvey, Michela A. Monninger, Kelsey J. Ramirez, Peter C. St. John, Sean P. Woodworth, Christopher W. Johnson et Gregg T. Beckham

Agile BioFoundry, Emeryville, Californie, 94608, États-Unis

Chen Ling, George L. Peabody, Davinia Salvachua, Young-Mo Kim, Colin M. Kneucker, Michela A. Monninger, Nathalie Munoz Munoz, Brenton C. Poirier, Kelsey J. Ramirez, Peter C. St. John, Sean P. Woodworth, Jon K. Magnuson, Kristin E. Burnum-Johnson, Adam M. Guss, Christopher W. Johnson et Gregg T. Beckham

Division des biosciences, Laboratoire national d'Oak Ridge, Oak Ridge, TN, 37831, États-Unis

George L. Peabody et Adam M. Guss

Laboratoire national du nord-ouest du Pacifique, Richland, WA, 99352, États-Unis

Young-Mo Kim, Nathalie Munoz Munoz, Brenton C. Poirier, Jon K. Magnuson et Kristin E. Burnum-Johnson

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CL, GLP, AMG, CWJ et GTB ont développé le concept du projet. Expériences conçues par CL, GLP, DS, AMG, CWJ et GTB. CL, GLP et CHC ont réalisé la construction d'ADN plasmidique et la construction de souches de P. putida. CL, GLP et MAM ont effectué des expériences de lecteur de plaque et de flacon agité. CMK a effectué des cultures en bioréacteur. Y.-MK, NMM, BCP, JKM et KEB-J. généré les données métabolomiques. PSJ a effectué une modélisation métabolique. KJR et SPW ont quantifié les analytes. CL, GLP, DS, CMK et Y.-MK ont effectué l'analyse des données. CL, DS, AMG, CWJ et GTB ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Adam M. Guss, Christopher W. Johnson ou Gregg T. Beckham.

CL, GTB, CWJ, AMG, GLP et DS sont les inventeurs d'un brevet provisoire américain (demande n° 63/321332) relatif à la production d'acide muconique à partir de sucres lignocellulosiques. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Tsutomu Tanaka et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Ling, C., Peabody, GL, Salvachúa, D. et al. Production d'acide muconique à partir de glucose et de xylose chez Pseudomonas putida via l'évolution et l'ingénierie métabolique. Nat Commun 13, 4925 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32296-y

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Reçu : 10 novembre 2021

Accepté : 25 juillet 2022

Publié: 22 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32296-y

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